金世龍，黃中榮，陳華，余天霧，曹洪，龍運全，周健，李鶴，茍毅，李遠，廖娟

在腫瘤組織中，極少量致瘤性細胞亞群具有無限增殖的潛能，對化療藥物存在抗藥性，它們在腫瘤組織中充當著干細胞的角色，并在啟動腫瘤形成和維持生長中起決定性作用。研究顯示，腫瘤復發(fā)和轉移的根源可能與腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)有關，且越來越多的研究注意到了CSCs的重要性，并在分選基礎上進行CSCs自我更新﹑分化，形成腫瘤球和移植成瘤能力等的分析[1-2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為第五大常見癌癥，病死率位居第三，治療效果差且易復發(fā)和轉移[3-5]。本研究采用CD13﹑CD133雙抗體分選人肝癌HuH7細胞系，研究CD13+CD133+HCC和CD13－CD133－HCC細胞的生物學特征，為臨床肝癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人肝癌HuH7細胞系由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院病理研究所提供。CD13熒光抗體(PE)購自BD公司；CD133熒光抗體(APC)購自美天尼公司；DMEM/F12(1:1)﹑DMEM培養(yǎng)基﹑胎牛血清(FBS)為Hyclone產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基為IVD產(chǎn)品。流式細胞儀BD FACS Aria Ⅱ和BD FACSCalibur，全波長酶標儀Thermo Multiskan Spectrum。

1.2 HuH7細胞培養(yǎng) HuH7細胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中于37℃﹑5%CO2﹑飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，待細胞融合度達到70%～80%時以0.25%胰酶消化細胞。

1.3 CD13+CD133+HCC細胞的分選 常規(guī)消化HuH7細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，PBS洗1次，置于1.5ml EP管中，設置空白對照組和CD13/CD133雙抗體組。每管中加入5μl抗體，4℃避光孵育30min，700r/min離心5min，棄上清，PBS洗3次，300μl PBS重懸細胞，流式細胞儀分選細胞。

1.4 CD13+CD133+﹑CD13－CD133－HCC細胞增殖情況 將分選后的HuH7細胞分別接種于96孔板，每孔加1×103個細胞，加入200μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，2～3d換液，每組設5個復孔及空白對照孔。培養(yǎng)24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，孵育4h，吸出培養(yǎng)基，加入150μl DMSO，室溫下振搖10min，在酶標儀上測定490nm處的吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線。

1.5 CD13+CD133+﹑CD13－CD133－HCC對5-FU和吡柔比星的敏感性分析 細胞貼壁后分別加入不同濃度5-FU(5﹑10﹑20μg/ml)和吡柔比星(1﹑10﹑20μg/ml)，每種濃度設5個復孔，設調零孔(不加細胞)和對照孔(不加藥物)，在37℃﹑5%CO2﹑飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別孵育24﹑48﹑72h，棄培養(yǎng)液，每孔分別加入180μl DMEM培養(yǎng)基和20μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸出培養(yǎng)液，分別加入150μl DMSO，室溫下振搖10min，在酶標儀上測定490nm處的A值，計算細胞存活率，確定細胞對抗癌藥物的敏感性。

1.6 裸鼠體內成瘤情況分析 將新分選的CD13+CD133+HCC細胞按1.0×103﹑5.0×103﹑1.0×104﹑5.0×104個細胞分為4組，采用PBS配成100μl細胞懸液，注射到裸鼠(清潔級)腹部皮下，每組5只。CD13－CD133－HCC細胞設1.0×104﹑1.0×105個細胞組做對照。每周觀察成瘤情況。

1.7 HuH7細胞系兩亞群的細胞周期測定 取HuH7細胞系兩亞群各1×106個分選細胞制成懸液；加入－20℃乙醇500μl固定，PBS洗滌，重懸；加入5μl RNase(50μg/ml)室溫放置20min，800r/min離心5min，細胞懸于95μl PBS；加入5μl PI溶液(5μg/ml)，冰上放置30min，流式細胞儀檢測DNA含量。

1.8 流式細胞術檢測HuH7細胞系兩亞群的分化情況 常規(guī)消化HuH7細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，PBS洗1次，置于1.5ml EP管中，設置空白對照管﹑CD13﹑CD133﹑CD13-CD133雙抗體4組。每管中加入5μl抗體，4℃避光孵育30min，700r/min離心5min，棄上清，PBS洗3遍，300μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測CD13﹑CD133標志表達情況。

2 結 果

2.1 CD13+CD133+和CD13－CD133－HCC細胞生長曲線 CD13+CD133+HCC細胞增殖較快，最初2d為平臺期，至第3天增殖明顯；而CD13－CD133－HCC增殖較慢，到第7天增殖加快，但只有CD13+CD133+HCC的1/2(圖1)。

圖1 HuH7細胞亞群生長曲線比較Fig.1 The growth curves of subgroup of HuH7 cells

2.2 HuH7兩種細胞亞群對5-FU和吡柔比星的敏感性分析 30μg/ml 5-FU持續(xù)作用48h后，CD13+CD133+HCC細胞存活率為70%，對5-FU抵抗；而CD13－CD133－HCC細胞較易被殺死，10μg/ml 5-FU作用48h后細胞存活率僅為40%，30μg/ml作用48h細胞存活率為10%(圖2A)，兩亞群對5-FU的反應存在較大差異。不同濃度吡柔比星作用48h仍有10%～40%CD13+CD133+HCC細胞存活，耐受性強于CD13－CD133－HCC(圖2B)，提示CD13+CD133+HCC細胞具有抗化療特征。

2.3 CD13+CD133+HCC細胞在裸鼠體內的成瘤情況 1×103個CD13+CD133+HCC細胞在裸鼠體內即可成瘤(1/5)，1×104個CD13+CD133+HCC細胞可使4只裸鼠成瘤(4/5)；而1×104個CD13－CD133－HCC不能成瘤(0/5)，1×105個CD13－CD133－HCC細胞才能成瘤(2/5)。提示CD13+CD133+HCC細胞具有分化成癌細胞以及自我更新的能力，具備CSCs的特征。

圖2 5-FU(A)及吡柔比星(B)處理48h后CD13+CD133+和CD13－CD133－HCC細胞存活率比較Fig.2 Comparison of survival rate between CD13+CD133+and CD13－CD133－HCC cells treated by 5-FU (A) or pirarubicin (B) for 48h

2.4 流式細胞儀檢測HuH7細胞系兩亞群的細胞周期差異 細胞周期檢測結果顯示，78.45%的CD13+CD133+HCC細胞處于G0/G1期(圖3A)，2.19%處于G2/M，19.36%處于S期，G2/G1為2.0。62.18%的CD13－CD133－HCC細胞處于G0/G1期(圖3B)，11.88%處于G2/M期，25.94%處于S期。

2.5 流式細胞儀檢測HuH7細胞系兩亞群的分化情況 HuH7細胞系按CD13﹑CD133表達情況分為4個亞群，即CD13+CD133+﹑CD13+CD133－﹑CD13－CD133+和CD13－CD133－HCC細胞，其中以CD13+CD133+HCC亞群居多(圖4A)。培養(yǎng)10d后，CD13+CD133+HCC亞群細胞的CD13﹑CD133標志表達與HuH7細胞系相近(圖4B)，有重建HuH7細胞的趨勢；而CD13－CD133－HCC細胞亞群分化后以表達CD133標志為主(圖4C)，不能完全重建HuH7細胞系的腫瘤狀態(tài)。

圖3 HuH7細胞系兩亞群的細胞周期分布Fig.3 The cell cycle of CD13+CD133+HCC cells(A) and CD13－CD133－HCC cells (B)

圖4 培養(yǎng)10d后CD13﹑CD133表達情況檢測Fig.4 CD13 and CD133 expression 10 days after cultivation

3 討 論

國內外研究表明，肝癌細胞系(Hep3B﹑HuH7﹑PLC/PRF/5)和肝癌組織中存在CD133+HCC細胞，這部分細胞對5-FU和阿霉素等化療藥物存在抵抗，細胞增殖較CD133－HCC細胞快，干細胞培養(yǎng)條件下具有形成腫瘤球的能力，裸鼠移植能夠成瘤，被視為肝CSCs[6-7]。CD13是半休眠的CSCs標志物，具有減輕放化療后DNA損傷和抗凋亡的作用，在肝癌組織和細胞中均有表達，CD13+HCC主要處于G0/G1期，可形成癌中心細胞克隆[8-9]。

本研究采用CD133﹑CD13標志，從HuH7細胞系分選出CD13+CD133+HCC細胞，占HuH7細胞總數(shù)的23.8%，且78.45%的CD13+CD133+HCC細胞處于G0/G1期，2.19%處于G2/M期，19.36%處于S期，G2/G1為2.0，具備CSCs的特征；而62.18%的CD13－CD133－HCC細胞處于G0/G1期，11.88%處于G2/M期，25.95%處于S期。兩細胞亞群所處的細胞周期有明顯差異。目前國內尚未見采用CD133﹑CD13標志分選肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)的研究報告。

常規(guī)培養(yǎng)CD13+CD133+HCC細胞，可見其增殖明顯快于CD13－CD133－HCC細胞，CD13+CD133+HCC細胞多數(shù)處于G0/G1期，但增殖曲線顯示快速增長，可能與新分選的CD13+CD133+HCC細胞多數(shù)處于G0/G1期，在加血清培養(yǎng)后部分LCSCs細胞分化成HCC細胞，部分LCSCs細胞增殖更新，而后者可以分泌HGF等因子促進HCC增殖，重建HuH7細胞系原有的細胞體系等因素有關[10-12]，而CD13－CD133－HCC細胞處于G1/G2，有追蹤研究顯示CD13－CD133－HCC細胞有破碎及凋亡改變[8-9]。

F A C S分選的C D 1 3+C D 1 3 3+H C C和CD 1 3－CD 1 3 3－H CC細胞經(jīng)過1 0 d培養(yǎng)后，CD13+CD133+HCC亞群的CD13﹑CD133標志表達與HuH7細胞系相近，提示其可分化出其他3個亞群的肝癌細胞，且具有自我更新能力，有重建HuH7細胞的趨勢，而CD13－CD133－HCC亞群分化后以CD133標志為主，不能維持或重建HuH7細胞系的腫瘤狀態(tài)。1×103個CD13+CD133+HCC細胞在裸鼠體內即可成瘤，而CD13－CD133－HCC需要105個細胞才能成瘤，提示前者具有更強的分化成癌細胞及自我更新能力，具有CSCs的特征。CD13+CD133+HCC細胞對5-FU和吡柔比星具有抵抗特性，而CD13－CD133－HCC亞群易于殺滅，CD13+CD133+HCC細胞可減輕放化療后的DNA損傷并具有抗凋亡作用，提示臨床化療難以徹底殺滅肝CSCs。

分析兩種亞群細胞的差異性具有重要的臨床意義，CD13+CD133+HCC細胞具有LCSCs的特征，可以稱為CD13+CD133+LCSCs，殘存CSCs可以形成轉移癌灶，是肝癌治療的靶細胞，這些LCSCs可能是肝癌復發(fā)和轉移的根源，在臨床治療中應重點殺滅LCSCs，而少量CD13－CD133－HCC細胞易于被化療藥物殺滅。

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