周和平，朱海龍，顧春虎，陳濤，熊紅燕，孫國(guó)成

目前慢性心力衰竭的發(fā)病率及病死率均較高[1-2]，且機(jī)制仍不明確。能量代謝異常與心力衰竭的相關(guān)性以及兩者之間可能存在的因果關(guān)系近年來受到廣泛關(guān)注，但目前尚無資料表明哪種糾正代謝異常的治療措施具有確切的療效。一般認(rèn)為，在中晚期或終末期心力衰竭時(shí)，脂肪酸的氧化代謝顯著下調(diào)，心肌更多地利用葡萄糖作為代謝底物[2]；在肥厚的心臟中存在葡萄糖利用及糖酵解過程增強(qiáng)﹑有氧氧化過程相對(duì)減弱，即“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”現(xiàn)象[3]，但其具體的病理生理意義仍不清楚。二氯乙酸(dichloroacetate，DCA)是一種特異作用于線粒體的小分子化合物，可通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶活性激活丙酮酸脫氫酶(PDH)，增強(qiáng)線粒體的氧化磷酸化，從而改善胞質(zhì)內(nèi)糖酵解和線粒體內(nèi)有氧氧化之間的脫耦聯(lián)[4]，但有關(guān)其改變葡萄糖代謝途徑后對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)和功能有何影響仍不明確。本研究旨在明確葡萄糖“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”在慢性心力衰竭進(jìn)展過程中的作用，進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)葡萄糖代謝在心力衰竭病程中的作用及機(jī)制，以期從改善代謝的角度為防治心力衰竭提供新策略和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物﹑試劑及儀器 鼠齡10周左右的雄性近交系C57BL/6J小鼠62只，新生Wistar大鼠(1～3d)15只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。低糖DMEM培養(yǎng)基﹑Percoll分離液﹑胎牛血清(Gibco BRL公司)，抗磷酸化丙酮酸脫氫酶(p-PDH)抗體(Calibio公司)，抗PDH抗體(MitoSciences公司)，抗GAPDH抗體(Cell signaling公司)，二氯乙酸(DCA，Sigma公司)。體視顯微鏡(Leica公司)，vevo770超聲分析系統(tǒng)(Visual Sonics公司)，LAS-3000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(富士公司)。

1.2 慢性心力衰竭模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 本研究采用國(guó)際上通用的主動(dòng)脈縮窄(transaortic constriction model，TAC)模型[5]作為左室壓力超負(fù)荷模型。小鼠麻醉后行氣管插管﹑接小型動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸支持頻率40次/min，用1%～2%的異氟烷維持麻醉。從小鼠左側(cè)第2肋間進(jìn)胸，在體視顯微鏡下分離主動(dòng)脈弓，在左右頸動(dòng)脈之間分離橫主動(dòng)脈，放置27號(hào)針頭，用10-0尼龍線打結(jié)后迅速抽出針頭。檢查無出血后，分別縫合肌層與皮膚。假手術(shù)組處理同上，但不進(jìn)行結(jié)扎。動(dòng)物分組：①將10只正常小鼠分為DCA處理組(n=5)及對(duì)照組(n=5)，以觀察DCA處理對(duì)正常小鼠心肌組織p-PDH表達(dá)的影響。②將假手術(shù)組及TAC術(shù)后3d﹑2周﹑20周不同時(shí)間點(diǎn)各4只(共16只)小鼠用于分析TAC術(shù)后p-PDH的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化；將12只小鼠分為假手術(shù)組﹑TAC組及TAC+DCA處理組(160mg/kg[4]加入飲水中)，每組4只，用于分析DCA處理對(duì)TAC術(shù)后第3天p-PDH表達(dá)的影響。③另將24只TAC小鼠分為DCA處理組(160mg/kg[4]加入飲水中，n=12)及對(duì)照組(正常飲水，n=12)，以觀察DCA處理對(duì)TAC模型小鼠心功能和生存率的影響。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 小鼠麻醉后仰臥位固定于vevo770超聲分析系統(tǒng)操作臺(tái)上，用1%～2%的異氟烷維持麻醉。先從主動(dòng)脈弓切面證實(shí)TAC模型，彩色多普勒分析縮窄處最大血流速度和壓差，將縮窄率為＜60%或＞80%的動(dòng)物篩除(與國(guó)際報(bào)道的70%左右的狹窄率保持一致)。維持小鼠心率在450次/min左右，采用美國(guó)超聲協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)的前緣標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量左室收縮末期和舒張末期內(nèi)徑(LVESD和LVEDD)，左室收縮功能射血分?jǐn)?shù)(EF)按下列公式計(jì)算：EF(%)=[(LVEDV–LVESV)/LVEDV]×100。

1.4 Western blotting檢測(cè)p-PDH及PDH的表達(dá) 分別于TAC術(shù)后3d﹑2周﹑20周將小鼠脫頸處死，即刻取出心臟，將心肌組織用預(yù)冷至0℃的PBS(pH 7.4)清洗后移入預(yù)冷的裂解液(Tris·HCl 20mmol/L﹑NaCl 50mmol/L﹑NaF 50mmol/L﹑Na4P2O750mmol/L﹑Sucrose 250mmol/L﹑Na3VO42mmol/L﹑DTT 1mmol/L和1%復(fù)合型蛋白酶抑制劑)中并剪碎。組織勻漿后于4℃ 12 000×g離心10min，取上清；采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，樣品行SDSPGEA電泳，采用半干電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h；將PVDF膜和一抗(PDH和p-PDH單抗)一起預(yù)處理，4℃過夜；用PBST緩沖液漂洗，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在37℃預(yù)處理1h；洗去所有未結(jié)合的二抗，使用ECL-plus免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.5 新生大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用新生Wistar大鼠(1～3d)，開胸摘取心臟后放入盛有預(yù)冷(4℃)的無鈣鎂PBS平皿中洗去血凝塊和紅細(xì)胞，并剪去心房，將心肌剪成約1mm3大小的碎塊，放入三角燒瓶中；加入10倍體積0.05%的胰酶，在磁力攪拌器上磁力消化(100r/min×10min，35～37℃)；消化完后用吸管輕輕吹打，靜置2min，自然沉淀，棄上清(上清液內(nèi)主要含紅細(xì)胞﹑細(xì)胞碎屑及死亡細(xì)胞)；再次消化，反復(fù)2次后，取上清。將上清移入無菌離心管中，加入4℃預(yù)冷的含小牛血清的DMEM終止胰酶作用，輕吹﹑混勻后，1000r/min×10min﹑4℃離心，棄上清，反復(fù)3次，以洗去殘存胰酶。在各次消化所得的細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液，集中混勻制成懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用含10%小牛血清的DMEM液接種培養(yǎng)，24h換液1次，48h后改用無血清的DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.6 DCA處理對(duì)心肌細(xì)胞p-PDH表達(dá)的影響 分別用5﹑10﹑30mmol/L的DCA與心肌細(xì)胞共同孵育，3h后提取細(xì)胞總蛋白行Western blotting檢測(cè)分析p-PDH表達(dá)的變化，同時(shí)按照試劑盒說明書行免疫細(xì)胞熒光染色。

1.7 TUNEL法原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡 操作按試劑盒說明書進(jìn)行。心肌組織常規(guī)石蠟包埋，每一個(gè)標(biāo)本取3個(gè)不同部位切片，厚4μm。心肌細(xì)胞核用DAPI襯染呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈深淺不一的綠色顆粒狀。在計(jì)算機(jī)圖像分析儀上，在400倍視野下，每張切片拍攝5個(gè)陽性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞核，陽性細(xì)胞所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(AI)。AI=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。AI作為心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量的半定量參數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)(unpaired Student's t-test)，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠TAC模型的超聲分析結(jié)果 超聲心動(dòng)圖分析進(jìn)一步證實(shí)，手術(shù)狹窄能穩(wěn)定地控制在70%左右，圖1左側(cè)血流頻譜顯示最大血流速度在3.5～4.0m/s，右側(cè)彩色多普勒測(cè)得跨狹窄處壓力差50～60mmHg，且在狹窄處可見明顯的五彩血流信號(hào)(圖1)。

2.2 慢性心力衰竭進(jìn)展過程中p-PDH的動(dòng)態(tài)表達(dá)采用TAC模型小鼠分析慢性心力衰竭進(jìn)展過程中

p-PDH表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并以此間接反映糖酵解和氧化磷酸化的相對(duì)水平(p-PDH的表達(dá)與糖酵解水平呈正相關(guān)，與氧化磷酸化水平呈負(fù)相關(guān))。Western blotting結(jié)果顯示，小鼠TAC模型中p-PDH的表達(dá)在術(shù)后第1天即開始升高，在術(shù)后第3天達(dá)到峰值，術(shù)后2周仍升高，而在術(shù)后20周時(shí)表達(dá)很低(圖2)。

2.3 DCA對(duì)p-PDH表達(dá)的影響 體外實(shí)驗(yàn)證明藥物DCA可以使培養(yǎng)的心肌細(xì)胞p-PDH表達(dá)降低且呈劑量依賴性，并在10.0mmol/L時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)，免疫細(xì)胞熒光染色進(jìn)一步證明了DCA的作用(圖3)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，并在正常小鼠中，DCA處理可增強(qiáng)有氧氧化即p-PDH表達(dá)降低；在TAC模型小鼠中，DCA可改善慢性心肌肥厚過程中的糖酵解增強(qiáng)﹑有氧氧化降低(圖4)，從動(dòng)物水平證明了DCA(160mg/kg)的有效性。

2.4 DCA處理對(duì)TAC小鼠心功能的影響 用DCA藥物被動(dòng)地改善“糖酵解-氧化磷酸化脫耦聯(lián)”﹑加強(qiáng)線粒體氧化磷酸化并不能改善肥厚心臟的心功能，相反卻加速了心功能的惡化，TAC術(shù)后4﹑10周，DCA處理組心功能明顯差于TAC模型組(圖5﹑6)，進(jìn)而小鼠20周生存率降低(圖7)。

圖1 小鼠TAC模型的超聲分析Fig.1 Echocardiographic analysis of TAC model of mice

圖2 TAC小鼠p-PDH水平的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic expression of p-PDH in TAC mice

圖3 DCA對(duì)心肌細(xì)胞p-PDH表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of DCA on cardiomyocyte p-PDH expression A. Western blotting result; B. Immunofluorescent staining

2.5 DCA處理對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL法半定量分析結(jié)果顯示，術(shù)后DCA處理組的凋亡指數(shù)(29.3±2.5)明顯高于單純TAC組(18.8±1.9，P＜0.05)，且兩組均明顯高于假手術(shù)組(9.1±1.5，P＜0.05，圖8)。

圖4 DCA對(duì)小鼠PDH及p-PDH蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of DCA on mice p-PDH and PDH expression A. Normal mice; B. TAC mice

圖5 TAC小鼠超聲心功能分析Fig.5 Cardiac function evaluation by echo in TAC mice

圖6 TAC小鼠EF的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic analysis of EF in TAC mice

圖7 TAC小鼠生存曲線Fig.7 Survival curve of TAC mice

圖8 心肌細(xì)胞凋亡(DAPI ×40)Fig.8 Apoptosis of cardiomyocyte (DAPI ×40)

3 討 論

已有文獻(xiàn)表明，在肥厚的心臟中存在葡萄糖利用及糖酵解過程增強(qiáng)﹑有氧氧化過程相對(duì)減弱的現(xiàn)象，這就是所謂的“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”[3]，但其具體的病理生理意義仍不明確。因糖酵解ATP生成效率遠(yuǎn)較有氧氧化為低，因此通常認(rèn)為“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”因能量供應(yīng)少而對(duì)心功能不利。然而，我們通過壓力超負(fù)荷模型和高血壓大鼠模型首次發(fā)現(xiàn)，“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”在慢性心力衰竭的進(jìn)展中可發(fā)揮代償性保護(hù)作用，而促進(jìn)糖酵解向有氧氧化轉(zhuǎn)化則加重心功能障礙，提示糖代謝異常對(duì)心力衰竭發(fā)展影響的新機(jī)制，與先前報(bào)道的文獻(xiàn)中右室肥厚中的變化規(guī)律一致[6]。

針對(duì)上述問題，我們想到在腫瘤細(xì)胞中存在著一個(gè)有趣的現(xiàn)象“Warburg效應(yīng)”。根據(jù)此效應(yīng)，在腫瘤細(xì)胞和增殖細(xì)胞中，無論氧供充足與否，大部分(85%左右)的葡萄糖都經(jīng)由丙酮酸代謝為乳酸，即“有氧糖酵解”；而在正常已分化組織中，在氧供充足時(shí)主要在線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化磷酸化，只有在缺氧應(yīng)激時(shí)葡萄糖才被代謝為乳酸，稱為“無氧糖酵解”[7]。腫瘤細(xì)胞采用這種相對(duì)低效率的ATP生成方式來提供自身代謝所需能量的可能原因有兩個(gè)：第一，補(bǔ)充用于細(xì)胞增殖所必需的生物大分子如核苷酸﹑氨基酸等；第二，減少線粒體氧化磷酸化過程活性氧自由基(ROS)的生成，線粒體氧化磷酸化是ROS生成的主要來源。另外，過多的ATP和檸檬酸會(huì)抑制糖酵解﹑減少磷酸戊糖代謝途徑的流量，從而使NADPH的生物合成減少，而NADPH是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的重要輔助因子，從而加重細(xì)胞的氧化損傷。因此可以推斷，腫瘤細(xì)胞采用有氧糖酵解作為能量代謝的方式主要是滿足增殖時(shí)對(duì)原材料的需要以及增強(qiáng)自身對(duì)外界各種不良應(yīng)激的抵抗性。

與腫瘤細(xì)胞的糖代謝狀況類似，在心力衰竭進(jìn)展的各個(gè)時(shí)期，均有心肌能量代謝的變化。因?yàn)樾氖抑貥?gòu)使單位重量的心肌毛細(xì)血管數(shù)目減少，氧的彌散間距增大，故心肌細(xì)胞缺氧。同時(shí)在肥厚心肌存在“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”，葡萄糖供能效率降低，這就加重了心肌的缺氧。慢性心力衰竭時(shí)多種因素導(dǎo)致氧化代謝受損，氧自由基生成增多，體內(nèi)活性氧堆積，形成氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究證實(shí)，增強(qiáng)葡萄糖的有氧氧化，可能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡與心臟重塑密切相關(guān)，心肌細(xì)胞凋亡很可能是有氧氧化增強(qiáng)使慢性心肌肥厚從“代償”向“失代償”轉(zhuǎn)折的關(guān)鍵因素[8]。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“糖酵解-有氧氧化脫耦聯(lián)”在慢性心力衰竭的進(jìn)展中可發(fā)揮代償性的保護(hù)作用；心肌的葡萄糖代謝從糖酵解向氧化磷酸化轉(zhuǎn)變促進(jìn)了代償性心肌肥厚向失代償性心力衰竭的轉(zhuǎn)變；葡萄糖氧化磷酸化促進(jìn)心力衰竭的機(jī)制與ROS生成增多從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增多有關(guān)。本研究結(jié)果揭示了心力衰竭失代償?shù)囊粋€(gè)新的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能為臨床從改善代謝的角度防治和延緩心力衰竭提供新策略和新靶點(diǎn)。

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