李萌萌，唐家廣，劉瑛輝，解葵，郝建華，陳軍

近年來(lái)臨床研究顯示，胎兒和新生兒期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，任何外來(lái)傷害性刺激均可影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，并對(duì)該個(gè)體成年后的痛行為產(chǎn)生不可忽視的影響[1-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，新生大鼠外周組織遭受持續(xù)傷害性刺激對(duì)其成年后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能有較大影響[4-5]，但生后不同發(fā)育時(shí)期的持續(xù)傷害性刺激對(duì)其成年后基礎(chǔ)痛閾及痛行為的影響目前尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究應(yīng)用具有多樣臨床病理性痛特征的蜜蜂毒動(dòng)物致痛模型對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器 SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程取仔鼠，每窩8～12只，共使用24窩。新生大鼠和母鼠單籠飼養(yǎng)，出生3周后按雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照IASP關(guān)于應(yīng)用清醒動(dòng)物進(jìn)行疼痛實(shí)驗(yàn)研究綱要的要求實(shí)施并完成[6]。實(shí)驗(yàn)用蜜蜂毒(bee venom，BV)購(gòu)自Sigma公司。RTY-3型自動(dòng)熱刺激儀，von-Frey纖毛機(jī)械刺激儀(刺激強(qiáng)度由大到小依次為150﹑120﹑90﹑60﹑45﹑35﹑30﹑20﹑15﹑10﹑8﹑4﹑2﹑1﹑0.7﹑0.4﹑0.2g)購(gòu)自西安峰嵐儀器廠。

1.2 動(dòng)物分組及處理 取生后第1﹑4﹑7﹑14﹑21﹑28天(即P1﹑P4﹑P7﹑P14﹑P21﹑P28)大鼠，每時(shí)間點(diǎn)取4窩，每窩隨機(jī)分為損傷組和對(duì)照組(n=20)，分別給予外周化學(xué)組織損傷(后肢足底皮下注射BV 20μl)或生理鹽水(normal saline，NS)20μl處理，仔鼠被飼養(yǎng)至成年(2個(gè)月齡)，測(cè)量每只成年大鼠的基礎(chǔ)痛閾值(熱刺激縮足反射潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值)，然后兩組大鼠均在左側(cè)后肢足底給予第二次外周化學(xué)組織損傷(0.4% BV 50μl)，測(cè)定持續(xù)自發(fā)痛(注射后1h內(nèi))及注射后2﹑4﹑8﹑24﹑48﹑72﹑96h的原發(fā)性熱或機(jī)械痛敏，以評(píng)價(jià)生后發(fā)育期傷害性刺激對(duì)其成年后痛行為的影響。

1.3 蜜蜂毒動(dòng)物痛模型的建立[7-8]采用粗制凍干蜜蜂毒素，用生理鹽水配制成不同濃度(0.025%﹑0.0375%﹑0.05%﹑0.1%﹑0.4%)，各年齡段大鼠給予最大劑量-反應(yīng)濃度[9]的蜜蜂毒溶液。實(shí)驗(yàn)者輕輕固定仔鼠，用50μl微量注射器分別抽取上述濃度蜜蜂毒20μl，將毒素液體注入大鼠左側(cè)后肢足底皮下，隨后將仔鼠放回長(zhǎng)方形塑料飼養(yǎng)盒內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)至2個(gè)月齡后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 痛定量測(cè)定方法[7-8]

1.4.1 持續(xù)自發(fā)痛 觀察記錄大鼠注射蜜蜂毒或生理鹽水后1h內(nèi)注射側(cè)每5min自發(fā)縮足反射的次數(shù)。

1.4.2 熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawl thermal latency，PWTL) 將大鼠置于底部為2mm厚玻璃板的透明有機(jī)玻璃箱(20cm×20cm×25cm)中，并放置在高出實(shí)驗(yàn)臺(tái)30cm處以便觀察。應(yīng)用RTY-3型熱刺激儀，選擇100W鹵素投射燈，調(diào)節(jié)電壓至10V，調(diào)節(jié)燈源與玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑為5mm，記錄從開(kāi)始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間(s)，重復(fù)測(cè)量3～5次，同一部位間隔10min，不同部位間隔5min，取平均值為熱刺激縮足反射潛伏期。大于40s無(wú)反應(yīng)則停止照射，以避免足底組織過(guò)度熱損傷。以組織損傷處理前的測(cè)定結(jié)果作為基礎(chǔ)PWTL。

1.4.3 機(jī)械刺激縮足反射閾值(paw withdrawl mechanical threshold，PWMT) 以不同粗細(xì)和長(zhǎng)度的尼龍絲制成17個(gè)刺激強(qiáng)度不同(0.2～150g)的von-Frey機(jī)械刺激器纖維。將20cm×20cm×25cm的透明有機(jī)玻璃箱放置于頂部為鐵絲網(wǎng)的30cm高的架子上，將待測(cè)大鼠置于箱中，適應(yīng)30min以上，使之從不安到逐漸安靜。實(shí)驗(yàn)者手持von-Frey纖維穿過(guò)鐵絲網(wǎng)格分別刺激大鼠兩側(cè)足底中心部位，刺激由小到大，每個(gè)強(qiáng)度反復(fù)刺激10次(間隔3～5s)，將出現(xiàn)縮足反射5次以上的強(qiáng)度作為大鼠的PWMT。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，損傷組和對(duì)照組之間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，不同年齡組間的比較采用ANOVA的Post hoc Fisher's檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)成年大鼠基礎(chǔ)痛閾的影響 P1﹑P4﹑P7﹑P14﹑P21﹑P28大鼠經(jīng)蜜蜂毒或生理鹽水處理，成年后基礎(chǔ)PWTL組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩側(cè)足底比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1A)，但P1﹑P4﹑P7﹑P14大鼠給予蜜蜂毒處理后，成年后雙側(cè)PWMT均明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P＜0.01，圖1B)。

2.2 對(duì)蜜蜂毒誘致的持續(xù)自發(fā)痛的影響 P1﹑P4﹑P7﹑P14大鼠經(jīng)蜜蜂毒處理，成年后蜜蜂毒誘致的持續(xù)自發(fā)痛顯著增強(qiáng)，從時(shí)程看，增強(qiáng)作用只發(fā)生在成年大鼠注射蜜蜂毒后0～25min或0～30min以內(nèi)(P＜0.05，圖2A﹑B)，而對(duì)30～60min時(shí)程內(nèi)的自發(fā)縮足反射次數(shù)無(wú)顯著影響(P＞0.05)。P21﹑P28大鼠經(jīng)蜜蜂毒處理，成年后蜜蜂毒誘致的持續(xù)性自發(fā)痛在前10～15min無(wú)顯著變化，但在15～60min時(shí)程內(nèi)的自發(fā)縮足反射次數(shù)明顯增多(P＜0.01，圖2C﹑D)。

2.3 對(duì)蜜蜂毒誘致的痛閾的影響 P1﹑P4﹑P7﹑P14﹑P21大鼠經(jīng)蜜蜂毒或生理鹽水處理后，至成年期熱痛敏感性無(wú)顯著差異(圖3)。P1大鼠經(jīng)蜜蜂毒或生理鹽水處理后成年期蜜蜂毒誘致的機(jī)械痛敏無(wú)明顯差異(圖4A)；P4﹑P7﹑P14大鼠經(jīng)蜜蜂毒處理后，至成年期蜜蜂毒誘致的機(jī)械痛敏或觸誘發(fā)痛完全消失，經(jīng)生理鹽水處理后，成年期仍可引起機(jī)械性痛敏(圖4B﹑C﹑D)；P21大鼠經(jīng)蜜蜂毒處理后，至成年期蜜蜂毒誘致的機(jī)械痛敏或觸誘發(fā)痛明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異顯著(圖4E)。

圖1 生后不同時(shí)間大鼠經(jīng)蜜蜂毒或生理鹽水處理對(duì)成年后基礎(chǔ)痛閾的影響Fig. 1 Effect of postnatal inflammation on baseline pain threshold in adult rats

圖2 生后不同時(shí)間大鼠外周蜜蜂毒處理對(duì)其成熟后持續(xù)自發(fā)痛反應(yīng)的影響(n=20)Fig. 2 Effects of postnatal inflammation on the continuous spontaneous pain in adult rats (n=20)(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group

3 討 論

本研究對(duì)大鼠生后不同發(fā)育期遭受持續(xù)傷害性刺激對(duì)成年后痛行為的影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)的行為學(xué)觀察，結(jié)果顯示，生后不同發(fā)育階段受到持續(xù)傷害性刺激對(duì)大鼠成年后的熱痛潛伏期及熱痛敏感性無(wú)顯著影響，但對(duì)機(jī)械痛反射閾值及機(jī)械痛敏感性有較為明顯的影響，且不同發(fā)育階段受到傷害性刺激對(duì)成年后的影響也有所不同。

本研究結(jié)果提示，不同發(fā)育期傷害性刺激的經(jīng)歷均可增強(qiáng)成年后的持續(xù)自發(fā)痛反應(yīng)，但生后21d前與21d后處理對(duì)蜜蜂毒反應(yīng)時(shí)程的增強(qiáng)效果不盡相同。生后21d前處理主要增強(qiáng)成年大鼠持續(xù)自發(fā)縮足反射的早反應(yīng)相(0～25或0～30min)，而對(duì)晚反應(yīng)相無(wú)明顯影響；但出生21d之后處理卻只增強(qiáng)晚反應(yīng)相(10～60或15～60min)，而對(duì)即時(shí)反應(yīng)相無(wú)明顯影響。分析其原因可能是由于：①脊髓背角淺層在生后21d才完全由無(wú)髓C纖維占據(jù)，而在21d之前由A和C纖維共同支配[4,10]，脊髓背角淺層成熟前后給予傷害性刺激可能導(dǎo)致初級(jí)傳入終末及脊髓背角淺層神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育異常[5]；②出生21d前后持續(xù)傷害性處理對(duì)不同初級(jí)傳入纖維結(jié)構(gòu)和功能的影響可能不同，導(dǎo)致成熟大鼠初級(jí)傳入纖維發(fā)育異常[11]。此外，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)生后21d是新生大鼠傷害性感覺(jué)功能從非成熟發(fā)育到成熟的關(guān)鍵時(shí)點(diǎn)，21d前的傷害性處理既影響了非傷害性軀體感覺(jué)傳導(dǎo)通路，也影響了傷害性軀體感覺(jué)傳導(dǎo)通路和功能的發(fā)育，而21d之后的持續(xù)傷害性處理可能只影響傷害性軀體感覺(jué)傳導(dǎo)通路和功能，即出生后發(fā)育期的傷害性處理對(duì)外周及脊髓的結(jié)構(gòu)和功能具有雙重影響[5,11]。

圖3 生后不同時(shí)間大鼠外周蜜蜂毒處理對(duì)其成熟后原發(fā)性熱痛敏的影響Fig. 3 Effects of postnatal bee venom-induced inflammation on the primary thermalgesia in adult rats

圖4 生后不同時(shí)間大鼠外周蜜蜂毒處理對(duì)其成熟后機(jī)械痛敏或觸誘發(fā)痛的影響Fig. 4 Effects of postnatal bee venom-induced inflammation on mechanical threshold and haphalgsia in adult rats

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，成年大鼠熱痛潛伏期和熱痛敏感性不受新生期傷害性刺激的影響。大鼠出生后外周傷害性熱痛感受器如辣椒素受體1(vanilloid receptor-1，VR1)對(duì)化學(xué)性傷害刺激不敏感，不易引起外周傷害性熱痛感受器結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，但目前其機(jī)制尚不清楚[12-13]。最近已克隆出外周傷害性熱痛感受器VR-1或辣椒素樣受體1(vanilloid receptor like-1，VRL-1)[11]，VR-1和VRL-1在脊髓背角和脊髓的生后發(fā)育特點(diǎn)及其與痛敏感性的關(guān)系值得深入研究。另外，成年大鼠機(jī)械痛反射閾值和機(jī)械痛敏感性因在發(fā)育期受到傷害性刺激的時(shí)期不同而有顯著差別，與對(duì)照組相比，P4－P14大鼠給予蜜蜂毒處理可消除成年后的機(jī)械痛敏或觸誘發(fā)痛，而P21大鼠給予同樣處理卻可增強(qiáng)成年后的機(jī)械痛敏強(qiáng)度。在新生大鼠特異傷害性感覺(jué)通路成熟之前皮下注射蜜蜂毒可嚴(yán)重影響機(jī)械痛敏的發(fā)生及持續(xù)慢性化關(guān)鍵因素(神經(jīng)或非神經(jīng)因素)的成熟，從而使其成年后不發(fā)生機(jī)械痛敏或觸痛；但在大鼠特異傷害性感覺(jué)通路成熟之后，同樣的處理不僅不能消除成年期的機(jī)械痛敏或觸誘發(fā)痛，反而對(duì)其有顯著增強(qiáng)效果，其機(jī)制目前尚不明了。近年來(lái)有研究報(bào)道成年大鼠穴位注射蜜蜂毒素可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[14]，臨床研究發(fā)現(xiàn)新生兒接受純化的蜜蜂毒素接種可獲得成年后對(duì)毒素引起的過(guò)敏反應(yīng)的免疫效應(yīng)[15]。有關(guān)新生大鼠皮下蜜蜂毒注射對(duì)成年機(jī)械痛敏作用影響的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究采用的蜜蜂毒試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪顷愜娧芯拷M近十年來(lái)開(kāi)發(fā)的具有多樣臨床病理痛特點(diǎn)的動(dòng)物行為模型，大鼠一側(cè)后肢皮下注射蜜蜂毒液可立即引起一個(gè)持續(xù)1h左右的持續(xù)自發(fā)痛行為反應(yīng)(表現(xiàn)為持續(xù)自發(fā)縮足反射﹑抬足舔足)，2h后可鑒定出發(fā)生在注射部位的原發(fā)性熱﹑機(jī)械性痛敏，以及遠(yuǎn)離損傷部位的繼發(fā)性熱痛敏和發(fā)生在非注射側(cè)后肢的“鏡像”熱痛敏[11-13,16]。該模型能較好地模擬臨床病理性痛的發(fā)生和持續(xù)慢性化機(jī)制，并能較客觀地記錄疼痛的強(qiáng)度及定量測(cè)定痛敏情況。Ruda等[1]報(bào)道新生動(dòng)物給予完全弗氏佐劑處理可以使皮下注射福爾馬林誘導(dǎo)的第二相反應(yīng)時(shí)程曲線左移，而第一相無(wú)明顯變化，但沒(méi)有觀察到福爾馬林反應(yīng)強(qiáng)度有任何改變。與福爾馬林實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖啾?，成熟大鼠蜜蜂毒反?yīng)強(qiáng)度(即每5min持續(xù)自發(fā)反射次數(shù)或1h總次數(shù))在生后發(fā)育期接受傷害性刺激后顯著增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能反映新生期持續(xù)炎癥傷害處理對(duì)成熟大鼠持續(xù)自發(fā)痛反應(yīng)程度的影響。

綜上所述，結(jié)合以往臨床觀察和本研究結(jié)果，生后不同時(shí)期經(jīng)歷傷害性刺激或痛體驗(yàn)可導(dǎo)致成年后痛感覺(jué)和相關(guān)生理功能異常，伴隨的應(yīng)激狀態(tài)還可能引起神經(jīng)和(或)精神系統(tǒng)發(fā)育不良。這些痛行為的異常表現(xiàn)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)在生后發(fā)育階段遭受持續(xù)傷害刺激而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和功能的不可逆改變具有密切關(guān)系，但其發(fā)生機(jī)制與形態(tài)學(xué)證據(jù)尚需進(jìn)一步深入研究。

[1] Ruda MA, Ling QD, Hohmann AG, et al. Altered nociceptive neuronal circuits after neonatal peripheral inflammation[J].Science, 2000, 289(5749): 628-631.

[2] Fitzgerald M, Beggs S. The neurobiology of pain: developmental aspects[J]. Neuroscientist, 2001, 7(3): 246-257.

[3] Hohmann AG, Neely MH, Pina J, et al. Neonatal chronic hind paw inflammation alters sensitization to intradermal capsaicin in adult rats: a behavioral and immunocytochemical study[J]. J Pain, 2005, 6(12): 798-808.

[4] Back SK, Kim MA, Kim HJ, et al. Developmental characteristics of neuropathic pain induced by peripheral nerve injury of rats during neonatal period[J]. Neurosci Res, 2008, 61(4): 412-419.[5] Fitzgerald M. The development of nociceptive circuits[J]. Nat Rev Neurosci, 2005, 6(7): 507-520.

[6] Zimmerman M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in concious animals[J]. Pain, 1983, 16(2):109-110.

[7] Chen J, Luo C, Li H, et al, Primary hyperalgesia to mechanical and heat stimuli following subcutaneous bee venom injection into the plantar surface of hindpaw in the conscious rat: a comparative study with the formalin test[J]. Pain, 1999, 83(1): 67-76.

[8] Lariviere WR, Melzack R. The bee venom test: a new tonic-pain test[J]. Pain, 1996, 66(2-3): 271-277.

[9] Li MM, Chen HS, Tang J, et al. Characterization of nociceptive responses to bee venom-induced inflammation in neonatal rats[J]. Brain Research, 2012, 1472: 54-62

[10] Walker SM, Meredith-Middleton J, Cooke-Yarborough C, et al.Neonatal inflammation and primary afferent terminal plasticity in the rat dorsal horn[J]. Pain, 2003, 105(1-2): 185-195.

[11] Chen J. Spinal processing of bee venom-induced pain and hyperalgesia[J]. Sheng Li Xue Bao, 2008, 60(5): 645-652.

[12] Chen J, Li HL, Luo C, et al. Involvement of peripheral NMDA and non-NMDA receptors in development of persistent firing of spinal wide-dynamic-range neurons induced by subcutaneous bee vonem injection in the cat[J]. Brain Res,1999, 844(1-2): 98-105.[13] Chen HS, Chen J, Guo WG, et al. Establishment of bee venominduced contralateral heat hyperalgesia in the rat is dependent upon central temporal summation of afferent input from the site of injury[J]. Neurosci Lett, 2001, 298(1): 57-60.

[14] Muller UR. New development in the diagnosis and treatment of hymenoptera venom allergy[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2001,124: 447-453.

[15] Akdis CA, Blaser K. Mechanisms of allergen-specific immunotherapy[J]. Allergy, 2000, 55(6): 522-530.

[16] Chen HS, Chen J, Sun YY. Contralateral heat hyperalgesia induced by unilaterally intraplantar bee venom injection is produced by central changes: a behavioral study in the conscious rat[J]. Neurosci Lett, 2000, 284(1-2): 45-48.