李祥柱，張鵬，韓曉鳳，李美玲，夏飛，郭風(fēng)勁

IRE1α(type Ⅰ transmembrane protein kinase/endoribonuclease)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白，為具有激酶(kinase)和核糖核酸內(nèi)切酶(RNase)活性的雙功能酶。細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)時(shí)，可誘導(dǎo)IRE1α的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔側(cè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化，激活胞質(zhì)的蛋白激酶域，發(fā)生自身磷酸化[1]，進(jìn)一步激活特定位點(diǎn)羧基末端具有核糖核酸內(nèi)切酶活性的RNase結(jié)構(gòu)域，從而剪切一種重要的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1(X-box binding protein 1)[2]。這種非經(jīng)典的mRNA剪接方式會(huì)引起一種稱作未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，該過(guò)程可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力。有關(guān)IRE1α如何活化，以及如何調(diào)控UPR信號(hào)以確保充分的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)目前尚未明確。為此，本研究構(gòu)建了含全長(zhǎng)IRE1α的腺病毒載體和一個(gè)缺少氨基末端和部分膜旁Linker區(qū)域的截短體，該突變體能夠自我聯(lián)合且在非應(yīng)激條件下不能與結(jié)合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein，BiP)結(jié)合。本研究觀察上述兩個(gè)重組腺病毒載體對(duì)軟骨干細(xì)胞ATDC5增殖和凋亡的影響，為進(jìn)一步探討IRE1α的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.l(-)-IRE1﹑pcDNA3.l(-)-R+K由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[3]，穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV﹑腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1﹑大腸埃希菌BJ5183株﹑軟骨干細(xì)胞ADTC5由本實(shí)驗(yàn)中心保存。PmeⅠ﹑PacⅠ購(gòu)自NEB公司；T4DNA連接酶為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；XholⅠ﹑HindⅢ內(nèi)切酶及DNA回收試劑盒為大連寶生物(TaKaRa)公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體為Invitrogen公司產(chǎn)品。引物合成由大連寶生物(TaKaRa)公司完成。

1.2 IRE1α重組腺病毒載體的構(gòu)建

1.2.1 含IRE1α基因的重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 用XholⅠ/HindⅢ雙酶切經(jīng)測(cè)序鑒定構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體pcDNA3.l(-)-IRE1﹑pcDNA3.l(-)-R+K，獲取IRE1α基因全長(zhǎng)和具有RNase+Kinase兩個(gè)核心結(jié)構(gòu)域的截短體片段，克隆至同樣經(jīng)XholⅠ/HindⅢ雙酶切的腺病毒載體pAdTrack-CMV中，得到重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IRE1α﹑pAdTrack-R+K。

1.2.2 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將經(jīng)PmeⅠ線性化的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IRE1α﹑pAdTrack-R+K分別與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1通過(guò)電轉(zhuǎn)法進(jìn)行同源重組并轉(zhuǎn)入BJ5183感受態(tài)大腸埃希菌，經(jīng)卡那霉素篩選后挑取最小的克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初篩，然后用PacⅠ酶切鑒定重組子。將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取克隆擴(kuò)增，大量提取質(zhì)粒保存。

1.2.3 重組腺病毒顆粒的包裝 用PacⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒pAd-IRE1α﹑pAd-R+K，通過(guò)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。培養(yǎng)2d后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)7～10d后收集HEK-293細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞4次，離心收集含重組腺病毒pAd-IRE1α﹑pAd-R+K的上清。取含重組腺病毒的上清，重新感染HEK-293細(xì)胞以擴(kuò)增重組腺病毒。

1.2.4 重組腺病毒Ad-IRE1α﹑Ad-R+K目的基因的鑒定 取5 μ l病毒上清液，加入1 0 μ l蛋白酶K，55℃消化1h，煮沸5min，離心后取1～2μl稀釋后進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證重組腺病毒基因組中是否含有I R E 1 α基因。上游引物5'-ATCTGGGGTGCCTGGCACAGAA-3'，下游引物5'-AAGCTTTTTGAGCACATGCTTCGCTG-3'。1.2.5 ATDC5細(xì)胞最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定將收集到的病毒用GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行滴度測(cè)定[4]。取病毒上清，按MOI 0﹑1﹑2﹑5﹑10﹑25分別感染ATDC5細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。采用GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法粗略估計(jì)病毒上清中病毒顆粒的數(shù)量，Ad-GFP病毒滴度約為5×104U/ml，Ad-IRE1α﹑Ad-R+K病毒滴度均為1.5×104U/ml。

1.3 IRE1α重組腺病毒對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖和凋亡的影響

1.3.1 IRE1α重組腺病毒對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ATDC5細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)60%～80%時(shí)分別轉(zhuǎn)染腺病毒空對(duì)照質(zhì)粒pAd-GFP﹑重組腺病毒質(zhì)粒pAd-IRE1α和pAd-R+K，并設(shè)立未處理的陰性對(duì)照組(NC)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。一批樣本24h后加入終濃度為5μg/ml的衣霉素(tunicamycin，TM)處理24h，另一批不用TM處理。收集各組細(xì)胞，用1ml預(yù)冷的70%乙醇溶液固定18～24h后，加入等體積的PI染液混合，4℃放置20～30min，尼龍膜過(guò)濾，流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期情況(由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院完成)。

1.3.2 IRE1α重組腺病毒對(duì)ATDC5細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ATDC5細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)60%～80%時(shí)分別轉(zhuǎn)染腺病毒空對(duì)照質(zhì)粒pAd-GFP﹑重組腺病毒質(zhì)粒pAd-IRE1α和pAd-R+K，并設(shè)立未處理的陰性對(duì)照組(NC)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。24h后加入終濃度為5μg/ml的TM處理24h。收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀以Annixin PE法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況(由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院完成)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，組間比較采用多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IRE1α腺病毒載體的構(gòu)建

2.1.1 重組腺病毒載體的鑒定 電泳結(jié)果顯示，XholⅠ/HindⅢ雙酶切片段數(shù)目和大小與預(yù)期相符(圖1A)，證實(shí)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IRE1α和pAdTrack-R+K構(gòu)建成功。經(jīng)Pac Ⅰ酶切后，重組腺病毒質(zhì)粒pAd-IRE1α出現(xiàn)1條約30kb的大片段和1條約3.0kb的特征性小片段，重組腺病毒質(zhì)粒pAd-R+K出現(xiàn)1條約30kb的大片段和1條約4.5kb的特征性小片段(圖1B)，表明穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒同源重組成功。

2.1.2 重組腺病毒顆粒的包裝 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-IRE1α﹑pAd-R+K轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后的第2天，熒光顯微鏡下即可觀察到部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)GFP的細(xì)胞增多，熒光加強(qiáng)，表明HEK-293細(xì)胞中存在病毒的包裝和擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染4d后細(xì)胞呈現(xiàn)彗星狀的腺病毒病灶，6～8d后可觀察到細(xì)胞病變(CPE)，大部分包裝細(xì)胞變圓﹑脫落(圖2)。

圖1 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant adenovirus vector

2.1.3 重組腺病毒的鑒定 PCR鑒定結(jié)果證實(shí)重組腺病毒Ad-IRE1α﹑Ad-R+K基因組中均含有目的基因，電泳顯示為307bp的單一條帶(圖3)，表明重組腺病毒中含有IRE1α基因。

2.1.4 ATDC5細(xì)胞MOI的測(cè)定 將收集到的病毒上清按MOI為0﹑1﹑2﹑5﹑10﹑25分別感染ATDC5細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，結(jié)果顯示ATDC5細(xì)胞的最佳MOI為15。

2.2 IRE1α重組腺病毒對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖2 重組腺病毒顆粒的包裝Fig.2 Packed recombinant adenovirus particles

圖3 重組腺病毒的PCR鑒定Fig.3 PCR products of recombinant adenovirus

2.2.1 IRE1α重組腺病毒對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在無(wú)TM處理?xiàng)l件下，各組細(xì)胞周期無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而在TM刺激誘導(dǎo)ERS條件下，Ad-IRE1α﹑Ad-R+K組ATDC5細(xì)胞G1期比例(分別為60.72%﹑56.40%)明顯低于NC組﹑Ad-GFP對(duì)照組(分別為73.52%﹑74.95%，P＜0.05)，S期細(xì)胞比例(分別為27.05%﹑28.33%)明顯高于NC組﹑Ad-GFP對(duì)照組(分別為12.75%﹑13.3%，P＜0.05)，表明在ERS狀態(tài)下腺病毒Ad-IRE1α﹑Ad-R+K均可促進(jìn)ATDC5細(xì)胞的增殖(圖4)。

2.2.2 IRE1α重組腺病毒對(duì)ATDC5細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，TM刺激誘導(dǎo)ERS條件下，感染Ad-IRE1α﹑Ad-R+K腺病毒上清后，ATDC5細(xì)胞的凋亡率分別為53.70%﹑64.72%，明顯高于NC組﹑Ad-GFP對(duì)照組(分別為26.84%﹑29.00%，P＜0.05)，表明Ad-IRE1α﹑Ad-R+K腺病毒上清均可促進(jìn)軟骨干細(xì)胞ATDC5的凋亡(圖5)。

3 討 論

ERS激活的一系列信號(hào)通路統(tǒng)稱為UPR，UPR的三個(gè)分支IRE1﹑PERK﹑ATF6均可促進(jìn)細(xì)胞存活，減少錯(cuò)誤折疊的蛋白，如果ERS沒(méi)有緩解，UPR的信號(hào)也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。UPR各信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的機(jī)制目前還不清楚，IRE1-XBP1信號(hào)通路是目前研究最多的。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中IRE1有兩個(gè)同源體，即IRE1α和IRE1β[5-6]，前者在體內(nèi)廣泛存在，而后者僅表達(dá)于胃腸道上皮細(xì)胞[7]。Cox等[8]研究認(rèn)為IRE1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白積聚引起的應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞的生存起關(guān)鍵作用，有利于血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[9]。Lin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)的ERS條件下，人HEK-293細(xì)胞中IRE1蛋白的表達(dá)逐漸衰減，而人為地維持IRE1的持續(xù)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖4 有/無(wú)TM處理?xiàng)l件下各組ATDC5細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.4 FCM results of ATDC5 cell cycle distribution assay with or without TM

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ATDC5細(xì)胞凋亡率Fig. 5 FCM assay on ATDC5 cell apoptosis rate

IRE1α的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域具有激酶和核糖核酸酶活性，缺失突變體分析表明這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域部分重疊[11]。在正常情況下，IRE1α通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有分子伴侶BiP相互作用維持單體狀態(tài)[12-13]，ERS條件下，BiP從IRE1α分離并轉(zhuǎn)而與積聚的未折疊蛋白結(jié)合，使IRE1α可以通過(guò)氫鍵結(jié)合形成二聚體[14]，二聚化又導(dǎo)致IRE1α蛋白胞質(zhì)域激酶和核糖核酸酶活性的激活[15]。但關(guān)于IRE1α是如何活化的至今仍存在分歧。Kohno等[16]認(rèn)為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中IRE1α的活化僅僅依賴于BiP從IRE1α分離，并不依賴于未折疊蛋白間的相互作用或IRE1α的其他組件。而Oikawa等[17]提出，IRE1的活化除了與BiP分離和自我聯(lián)合有關(guān)外，在細(xì)胞腔側(cè)還存在至關(guān)重要的未知變化。

本研究采用TM處理誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞進(jìn)入ERS狀態(tài)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染Ad-IRE1α﹑Ad-R+K腺病毒上清后的ATDC5的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，Ad-IRE1α﹑Ad-R+K組G1期細(xì)胞比例明顯低于NC組﹑Ad-GFP對(duì)照組(P＜0.05)，S期細(xì)胞比例明顯高于NC組﹑Ad-GFP對(duì)照組(P＜0.05)，表明腺病毒Ad-IRE1α﹑Ad-R+K均可在ERS狀態(tài)下促進(jìn)ATDC5細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。而在無(wú)TM處理?xiàng)l件下，各組細(xì)胞周期無(wú)顯著差異(P＞0.05)，表明pAd-R+K這個(gè)核心截短體重組腺病毒雖然能夠自我聯(lián)合且在非應(yīng)激條件下不與BiP結(jié)合，但其活化仍依賴于ERS。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，與Ad-GFP對(duì)照組比較，Ad-IRE1α﹑Ad-R+K細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，提示IRE1α可有效促進(jìn)軟骨干細(xì)胞ATDC5的凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的攜帶人IRE1α基因的重組腺病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高﹑易觀察等優(yōu)點(diǎn)，為下一步研究IRE1α的生物學(xué)功能調(diào)控，干細(xì)胞增殖﹑分化，以及相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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