耿焱，付煒，劉亞楠，彭娜，雷玉梅，蘇磊

根據(jù)勞力性因素的有無(wú)，熱射病(heat stroke，HS)分為勞力型熱射病(exertional HS，EHS)和經(jīng)典型熱射病(classic HS，CHS)[1-2]。CHS具有高發(fā)病率和病死率，由于發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床缺乏有效而特異性的治療手段，盡管采取了積極的降溫和相應(yīng)的臟器支持等處理措施，其病死率仍居高不下[3-6]。動(dòng)物模型尤其是小動(dòng)物模型對(duì)研究CHS的發(fā)病機(jī)制非常重要。目前普遍接受的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物HS診斷標(biāo)準(zhǔn)包括動(dòng)脈血壓下降[1-4]，因?yàn)檠獕簻y(cè)量困難，研究CHS的小動(dòng)物模型以大鼠為主，而大鼠動(dòng)脈血壓觀察的經(jīng)典方法是麻醉狀態(tài)下行股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)，但這種方法擾亂了大鼠在高溫環(huán)境下體溫調(diào)節(jié)的行為和生理機(jī)制，存在較大的混淆因素，影響了大鼠實(shí)驗(yàn)性CHS的研究。我們利用無(wú)創(chuàng)大鼠血壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，首次構(gòu)建了清醒狀態(tài)下的CHS大鼠模型，并對(duì)比了該模型與傳統(tǒng)麻醉狀態(tài)下CHS模型的異同，為進(jìn)一步研究自然狀態(tài)下大鼠CHS的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備 模擬熱氣候動(dòng)物艙(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶衛(wèi)生學(xué)學(xué)院提供)，BW-NIBP型無(wú)創(chuàng)大鼠鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)，Powlalr 8sp生理記錄儀(澳大利亞Adinstruments公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體重281～314g，于南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)2周左右，環(huán)境溫度23℃，濕度55%±5%，12h晝/夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為：常溫清醒狀態(tài)對(duì)照組(C-NC組)﹑常溫麻醉狀態(tài)左股動(dòng)脈插管對(duì)照組(N-NC組)﹑高溫清醒狀態(tài)組(C-CHS組)﹑高溫麻醉狀態(tài)左股動(dòng)脈插管組(N-CHS組)。C-NC組和C-CHS組大鼠在實(shí)驗(yàn)前接受2周無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量適應(yīng)性訓(xùn)練，頻率為2次/d。1.3 有創(chuàng)血壓測(cè)量 參照Hall等[4]和Yang等[7]的方法，于大鼠左股動(dòng)脈插管接生理記錄儀測(cè)量收縮壓(SBP)。N-NC組和N-CHS組大鼠在實(shí)驗(yàn)前2h接受左側(cè)股動(dòng)脈插管處理，具體步驟為：大鼠以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)；切開(kāi)左側(cè)腹股溝皮膚，分離約1cm股動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，向心臟方向插管并固定，連接三通管，以肝素鹽水125U/ml封管；穩(wěn)定10min后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量及驗(yàn)證 采用大鼠鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量SBP值，應(yīng)用有創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)驗(yàn)證。方法：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨機(jī)選取6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將N-NC組和N-CHS組大鼠連接無(wú)創(chuàng)大鼠鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x，同時(shí)進(jìn)行有創(chuàng)及無(wú)創(chuàng)SBP測(cè)量，對(duì)比兩種測(cè)量系統(tǒng)在測(cè)量值上的差異。

1.5 核心體溫測(cè)量方法 用生理記錄儀的熱電偶測(cè)量各組大鼠直腸溫度(Tr)，以Tr代表核心體溫。

1.6 熱打擊方法及監(jiān)測(cè)指標(biāo) 熱打擊前將高溫艙預(yù)熱到30℃，在熱打擊前20min(time –20)和10min(time –10)時(shí)點(diǎn)各測(cè)量核心體溫和SBP一次。熱打擊的方法：將C-CHS組和N-CHS組大鼠置于預(yù)熱至30℃的仿真熱氣候動(dòng)物艙(time 0)，30min內(nèi)將艙內(nèi)溫度升至39℃，濕度65%。N-CHS組大鼠連接Powlalr 8sp生理記錄儀，直腸內(nèi)放置熱電偶，每隔10min記錄SBP和Tr一次，根據(jù)大鼠意識(shí)狀態(tài)不定時(shí)少量補(bǔ)充10%水合氯醛，維持麻醉狀態(tài)。C-CHS組大鼠每10min連接一次無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)和直腸熱電偶，記錄SBP和Tr，達(dá)到CHS診斷標(biāo)準(zhǔn)后將大鼠從氣候艙取出。CHS診斷標(biāo)準(zhǔn)：核心體溫≥42℃，動(dòng)脈SBP從峰值開(kāi)始下降[5]。實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠均禁食﹑水，C-NC組和N-NC組大鼠全程置于23℃環(huán)境中。

1.7 恢復(fù)期處理方法 熱打擊結(jié)束后即進(jìn)入恢復(fù)期處理。N-NC組和N-CHS組大鼠結(jié)扎左側(cè)股動(dòng)脈，拔除插管，縫閉切口，停止使用水合氯醛。各組大鼠接受20min酒精擦浴全身降溫治療后，恢復(fù)進(jìn)食﹑水，放回原飼養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)觀察3d。

1.8 熱應(yīng)激計(jì)算方法 參考Leon等[8]的方法，通過(guò)量化計(jì)算方法對(duì)比不同HS組大鼠熱應(yīng)激反應(yīng)的異同。以熱暴露前的核心體溫和SBP為基線(xiàn)核心體溫和SBP，成模時(shí)(SBP從峰值開(kāi)始下降)的核心體溫為最大核心體溫，以到達(dá)最大核心體溫的時(shí)間代表總熱暴露時(shí)間。總熱負(fù)荷(℃·min)=核心體溫≥39℃的熱暴露時(shí)間×(最大核心體溫－39℃)。若核心體溫為39℃，則已經(jīng)與熱打擊環(huán)境溫度相同，在該溫度下大鼠已經(jīng)無(wú)法通過(guò)輻射散熱。以核心體溫≥42℃作為重度熱負(fù)荷的開(kāi)始，重度熱負(fù)荷(℃·min)=核心體溫≥42℃的熱暴露時(shí)間×(最大核心體溫－42℃)。核心體溫上升速率=(最大核心體溫－基線(xiàn)核心體溫)/總熱暴露時(shí)間×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，在方差齊性基礎(chǔ)上應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較最大核心體溫﹑總熱暴露時(shí)間﹑總熱負(fù)荷﹑重度熱負(fù)荷和核心體溫上升速率；應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，假設(shè)檢驗(yàn)采用log-rank法進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)的驗(yàn)證 利用有創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行的驗(yàn)證結(jié)果顯示，N-NC組大鼠兩種測(cè)量方式獲得的SBP測(cè)量值存在123.56mmHg差值，鼠尾動(dòng)脈測(cè)量值低于股動(dòng)脈測(cè)量值，但兩者變化趨勢(shì)一致；N-CHS組大鼠兩種測(cè)量方式獲得的測(cè)量值基本相同，考慮為高溫條件下鼠尾動(dòng)脈血流量增加，提高了鼠尾動(dòng)脈SBP測(cè)量的準(zhǔn)確性。鼠尾動(dòng)脈的舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)測(cè)量值不穩(wěn)定，且與股動(dòng)脈測(cè)量值相比有較大出入。驗(yàn)證結(jié)果提示，無(wú)創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量系統(tǒng)用于CHS模型大鼠的SBP測(cè)量是可行的，但DBP測(cè)量值不穩(wěn)定，不適用于平均動(dòng)脈壓的計(jì)算。因此，本實(shí)驗(yàn)參考Yang等[7]的方法，選用SBP從峰值開(kāi)始下降作為熱射病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 熱應(yīng)激體溫及血壓調(diào)節(jié)反應(yīng)特征 如圖1所示，熱暴露期間N-CHS和C-CHS組大鼠表現(xiàn)為不同的熱應(yīng)激反應(yīng)。隨熱暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，N-CHS組大鼠的核心體溫呈線(xiàn)性增高，直至達(dá)到最大核心體溫；C-CHS組大鼠在熱暴露期間，核心體溫呈三相式增高，表現(xiàn)為初始階段核心體溫快速上升，隨后表現(xiàn)為類(lèi)似于平臺(tái)的緩升期，緩升期持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，此后再次進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，直至達(dá)到最大核心體溫(圖1A)。N-CHS和C-CHS組大鼠在到達(dá)最大核心體溫前，SBP變化模式與核心體溫變化模式基本相同，在到達(dá)最大核心體溫時(shí)，SBP從峰值開(kāi)始下降(圖1B)。熱暴露各個(gè)時(shí)段，N-CHS和C-CHS組核心體溫﹑SBP均與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)。與C-NC組相比，N-NC組大鼠基線(xiàn)核心體溫和SBP水平較低(P＜0.05)。

圖1 清醒及麻醉狀態(tài)CHS模型大鼠核心體溫和SBP調(diào)節(jié)特征Fig.1 Core temperature and SBP response profiles in conscious and unconscious classic heat stroke rats

圖2 C-CHS和N-CHS組大鼠熱應(yīng)激核心體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)Fig.2 Quantitative analysis of the thermoregulatory responses of C-CHS and N-CHS rats

2.3 熱應(yīng)激體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)定量分析 如圖2所示，N-CHS和C-CHS組大鼠最大核心體溫?zé)o顯著差異(P＞0.05)，而N-CHS組大鼠核心體溫上升速率顯著快于C-CHS組大鼠(P＜0.05)，總熱負(fù)荷和重度熱負(fù)荷均顯著少于C-CHS組大鼠(P＜0.05)。

2.4 生存分析 N-CHS組大鼠在結(jié)束熱暴露后12h內(nèi)全部死亡，C-CHS組大鼠有5只在熱暴露后3d仍存活，生存分析顯示N-CHS組大鼠生存時(shí)間顯著短于C-CHS組大鼠(圖3，P＜0.05)。

圖3 N-CHS組和C-CHS組大鼠生存時(shí)間對(duì)比Fig.3 Time-survivor curve of N-CHS and C-CHS rats

3 討 論

臨床上有關(guān)CHS的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括核心體溫超過(guò)41℃，皮膚干熱﹑潮紅，同時(shí)伴神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[9-10]。與臨床工作不同的是實(shí)驗(yàn)中很難通過(guò)觀察上述癥狀來(lái)診斷大鼠CHS。因此，目前在CHS大鼠模型的研究中，以核心體溫超過(guò)41℃和SBP從峰值下降作為診斷實(shí)驗(yàn)性CHS的標(biāo)準(zhǔn)[7]。傳統(tǒng)的大鼠SBP測(cè)量方法為麻醉狀態(tài)下股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)，基于這種有創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)建立的CHS大鼠模型存在著不可忽視的方法學(xué)上的混淆因素，包括：麻醉可抑制體溫調(diào)節(jié)機(jī)制，影響熱應(yīng)激體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)[11-12]；在嚙齒動(dòng)物，向身體的腹側(cè)涂抹唾液是蒸發(fā)散熱必不可少的機(jī)制，然而在麻醉的情況下，這種行為受到抑制；股動(dòng)脈插管需要結(jié)扎一側(cè)股動(dòng)脈，結(jié)果導(dǎo)致心臟前負(fù)荷增加，以及同側(cè)后肢的缺血性損害及壞死，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生致命性影響。上述混淆因素?cái)_亂了動(dòng)物在高溫環(huán)境下調(diào)節(jié)體溫的正常行為和生理學(xué)機(jī)制，導(dǎo)致不自然的熱應(yīng)激反應(yīng)，影響了對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠CHS的研究[8]。

我們首次使用無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)構(gòu)建了清醒狀態(tài)下的CHS大鼠模型。對(duì)比麻醉和清醒狀態(tài)下CHS大鼠模型的熱應(yīng)激血壓和體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)兩者存在較大不同。清醒狀態(tài)CHS大鼠體溫調(diào)節(jié)呈現(xiàn)三相式模式，包括初始快速上升期﹑平臺(tái)樣緩升期和終末快速上升期，而麻醉狀態(tài)下的CHS大鼠體溫調(diào)節(jié)呈單相式線(xiàn)性增高。血壓調(diào)節(jié)也有類(lèi)似現(xiàn)象，只是到達(dá)最大核心體溫時(shí)從峰值開(kāi)始下降。進(jìn)一步定量分析熱應(yīng)激下體溫調(diào)節(jié)顯示，盡管兩種模型在最大核心體溫上無(wú)顯著差異，但對(duì)比清醒狀態(tài)下的CHS大鼠，麻醉狀態(tài)下CHS大鼠的核心體溫上升速率顯著加快，成模時(shí)間(總熱暴露時(shí)間)顯著縮短。三相式核心體溫調(diào)節(jié)特征更接近大鼠的自然狀態(tài)，表現(xiàn)為：熱應(yīng)激的初始階段，由于環(huán)境溫度大于核心體溫，導(dǎo)致無(wú)法代償?shù)臒嶝?fù)荷，出現(xiàn)核心體溫陡然上升；上升到大于環(huán)境溫度的水平后，清醒狀態(tài)下的大鼠可以通過(guò)涂抹唾液和尿液等行為加強(qiáng)蒸發(fā)散熱，從而將體內(nèi)的熱量有效散發(fā)到外界環(huán)境，減緩核心體溫的上升，導(dǎo)致出現(xiàn)可辨識(shí)的平臺(tái)樣緩升期；緩升期后核心體溫的第二次陡然上升直到最大核心體溫，提示體溫調(diào)節(jié)的破壞。受核心體溫的影響，SBP的調(diào)節(jié)水平也呈現(xiàn)類(lèi)似的三相式調(diào)節(jié)特征，直至達(dá)到最大核心體溫，此時(shí)SBP從峰值下降。麻醉狀態(tài)大鼠因?yàn)轶w溫調(diào)節(jié)的生理行為受抑制，因此表現(xiàn)為單相式線(xiàn)性上升。值得注意的是，盡管熱負(fù)荷定量分析顯示，麻醉狀態(tài)下CHS大鼠的總熱負(fù)荷和嚴(yán)重?zé)嶝?fù)荷均顯著低于清醒狀態(tài)下的CHS大鼠，但其預(yù)后更差，并且沒(méi)有大鼠的生存時(shí)間超過(guò)12h。我們推測(cè)可能與股動(dòng)脈結(jié)扎的副作用有關(guān)。以上結(jié)果表明，清醒狀態(tài)CHS模型更接近大鼠的生理狀態(tài)。

本研究結(jié)果證實(shí)，相比傳統(tǒng)的麻醉狀態(tài)CHS大鼠模型，基于無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)的清醒狀態(tài)CHS大鼠模型更適用于實(shí)驗(yàn)性大鼠CHS的研究。對(duì)于清醒狀態(tài)CHS大鼠模型的進(jìn)一步研究，可以促進(jìn)對(duì)CHS發(fā)病機(jī)制的理解。

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