魏玉香，周文強，肖漓，鄭德華，齊幟，蔡明，錢葉勇，于濤，廖珂，石炳毅

樹突細胞(DC)作為體內最有效的抗原呈遞細胞(APC)，不但具有免疫激活作用，而且在一定的成熟狀態(tài)下可誘導免疫耐受。DC的免疫調節(jié)作用與其發(fā)育成熟狀態(tài)密切相關[1-3]，未成熟DC(imDC)具有免疫負向調控作用，但在直接用于誘導移植免疫耐受的過程中，imDC易被刺激成熟，尤其是在體內存在炎癥的情況下(包括移植手術損傷)更是如此，因而不適用于體內誘導免疫耐受。筆者在前期研究中應用了一種吞噬了凋亡淋巴細胞的imDC，稱之為負載凋亡淋巴細胞的DCs(PUVA-SP DCs)，此種DC表達不成熟表型[4]。本研究比較脂多糖(LPS)刺激后，PUVA-SP DCs和imDC的表型及細胞因子分泌的變化，以探明PUVA-SP DCs對炎癥刺激的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 BALB/c(H-2d)﹑C57BL/6(H-2Kb)近交系小鼠，4～6周齡，雄性，SPF級，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。小鼠重組白細胞介素4(rmIL-4)﹑重組粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)購自Peprotech公司；胎牛血清﹑RPMI 1640培養(yǎng)基購自PAA Laboratories；LPS﹑光敏劑8-甲氧基補骨脂素(8-m ethoxypsoralen，8-MOP)購于Sigma公司；抗CD11c磁珠購自Miltenyi Biotec公司；各種熒光素標記的單抗CD80﹑CD86﹑CD40﹑MHC-Ⅱ以及同型對照抗體購自BD PharMingen或eBioscience公司；細胞因子IL-10﹑IL-12p70﹑IL-12p40的ELISA檢測試劑盒購自R&D公司。小鼠淋巴細胞分離液為天津市TBD生物技術發(fā)展中心產品；FACS Calibur流式細胞儀為美國Bacton Dickinson公司產品。

1.2 imDC的培養(yǎng) 小鼠骨髓來源DC的培養(yǎng)參考Inaba等[5]的方法并稍作改進：頸椎脫位法處死C57BL/6小鼠，無菌取股骨和脛骨，注射器反復沖洗，收集得到骨髓細胞懸液，1000×g離心5min；棄上清，加入2ml無菌Tris-NH4Cl溶液裂解紅細胞，1000×g離心5min，棄上清；洗滌后的細胞用含10%胎牛血清(FCS)﹑20ng/ml rmGM-CSF﹑10ng/ml rmIL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮，并分至6孔培養(yǎng)板中，每孔加入約4ml培養(yǎng)基，調整細胞密度為2×106/ml，置37℃﹑5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h；輕輕吹洗除去懸浮細胞，保留疏松貼壁細胞，加入新鮮的含有相同濃度rmGM-CSF﹑rmIL-4及10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～6d，用吸管輕輕吹打，收集所有懸浮細胞，無菌條件下用抗CD11c磁珠進行分選，獲得實驗所需骨髓來源的小鼠imDC。

1.3 脾淋巴細胞懸液(SP)的制備及PUVA處理 頸椎脫位法處死C57BL/6小鼠，無菌切取脾臟，移入4℃ PBS中；剪碎后經(jīng)100目篩網(wǎng)充分研磨，200目篩網(wǎng)過濾去除殘渣，獲得單細胞懸液；以淋巴細胞分離液Ficoll密度梯度法，1600r/min離心20min；取單個核細胞層，加入RPMI 1640液，重復洗滌2次；用RPMI 1640液重懸細胞，置于塑料平皿中，在37℃﹑5% CO2孵箱中孵育30min；除去貼壁單核細胞，獲得懸浮的脾淋巴細胞。采用臺盼藍染色法計算活細胞百分率，活細胞＞90%時用于實驗。采用8-MOP聯(lián)合A波段長波紫外線(UVA)照射的體外光化學方法(簡稱PUVA)處理鼠脾淋巴細胞。上述脾淋巴細胞中加入200ng/ml 8-MOP，在37℃﹑5%CO2﹑飽和濕度孵箱中孵育20min后，置于距離UVA光源20cm處，直接照射9min，照射強度為2J/cm2。照射結束后，用RPMI 1640重復洗滌2次，用含10% FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液懸浮細胞，在37℃﹑5%CO2﹑飽和濕度孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，得到PUVA處理后的供者小鼠脾淋巴細胞(PUVA-SP)。

1.4 吞噬經(jīng)PUVA處理淋巴細胞的樹突細胞(PUVA-SP DCs)的制備 在DC培養(yǎng)的第6天，按5:1比例加入經(jīng)PUVA處理的小鼠脾淋巴細胞，共培養(yǎng)16h，去除懸浮細胞，得到吞噬PUVA-SP的imDC(即PUVA-SP DCs)。

1.5 LPS刺激對imDC和PUVA-SP DCs的影響 將上述imDC和PUVA-SP DCs調整密度至1×106/ml，分別加入10ng/ml LPS刺激24h，得到LPS DCs。24h后，獲取上清，采用ELISA法檢測上清中不同細胞因子的濃度。收集上述各種DCs，用PBS洗滌2次，調整細胞密度至1×106/ml，每管加入100μl，分別加入FITC-MHC Ⅱ﹑APC-CD 40﹑PerCP-Cy-CD80或PE-CD86單克隆抗體，用相同熒光素標記的同型非特異性抗體作為同型對照。細胞于4℃避光孵育30min，再用PBS洗滌2次，采用流式細胞儀檢測細胞表面MHC-Ⅱ﹑CD40﹑CD86和CD80表達水平。

2 結 果

2.1 負載PUVA-SP對imDC免疫表型的影響 FCM檢測結果顯示，imDC與PUVA-SP混合培養(yǎng)后，其表面分子表達仍保持較低水平，CD80﹑CD86﹑CD40﹑MHC-Ⅱ的表達分別為22.72%﹑23.61%﹑21.81%﹑38.68%，與未經(jīng)任何處理的imDC相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明PUVA-SP并不刺激DC表型成熟。imDC以及PUVA-SP DCs分別與LPS混合培養(yǎng)后，imDC的表面分子CD80﹑CD86﹑CD40及MHC-Ⅱ的表達分別為50.58%﹑66.29%﹑71.20%及68.64%，而PUVA-SP DCs的表達分別為21.26%﹑38.50%﹑39.78%及67.29%，除MHC-Ⅱ外，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1)，表明吞噬了PUVA處理的脾淋巴細胞的imDC可以抵制LPS刺激導致的自身成熟。

2.2 PUVA-SP DCs對LPS刺激分泌細胞因子的影響 LPS刺激后，PUVA-SPDCs和imDCs分泌IL-10的水平分別為435.6±13.9pg/ml和132.6±2.8pg/ml，與未經(jīng)刺激前相比均增高，且前者增高的水平顯著高于后者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。LPS刺激后，imDCs分泌高水平IL-12，其中p70為192.1±5.9pg/ml，p40為999.8±26.9pg/ml，而PUVA-SP DCs IL-12的分泌水平為p70 18.56±1.3pg/ml，p40 15.22±1.2pg/ml，顯著低于imDCs，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖2)。

圖1 PUVA-SP DCs和imDC在LPS刺激前后的表型變化Fig.1 Phenotype changes of PUVA-SP DCs and imDC in terms of LPS responsiveness

3 討 論

DC是目前已知的體內最重要的專職性抗原呈遞細胞，能攝取﹑加工及呈遞抗原。一方面，DC可作為專職抗原呈遞細胞觸發(fā)和調節(jié)固有性及獲得性免疫反應，啟動免疫應答，介導移植免疫排斥反應；另一方面，DC通過多種機制誘導抗原特異性T細胞無能，且在免疫耐受中展示出極強的可塑性[6]。成熟的DC高表達共刺激分子﹑MHC-Ⅱ類分子和細胞間黏附分子(ICAM)等黏附分子，提呈抗原引發(fā)移植排斥反應；未成熟的DC低水平表達MHC-Ⅱ﹑MHC-Ⅰ﹑協(xié)同刺激分子(CD80﹑CD86)﹑黏附分子(CD40﹑CD44)等，雖具有極強的抗原攝取﹑加工處理能力，但激發(fā)免疫應答的能力較弱，通常介導致耐受作用[7-8]。如果直接將未成熟的DC用于移植受者作為誘導耐受方案應用，那么這些DC有可能在受者體內被激活，發(fā)揮提呈抗原﹑啟動免疫應答的作用，尤其是在潛在炎癥(包括移植手術損傷)的情況下[2-3]。危險信號理論認為，決定DC成熟與否的關鍵是在其荷載抗原的同時是否存在危險信號，有危險信號﹑荷載抗原的DC則趨于成熟；缺乏危險信號﹑荷載抗原的DC則趨于形成調節(jié)性DC，負向調節(jié)免疫反應。細胞凋亡系生理性細胞死亡，缺乏危險信號；而非凋亡性死亡(如壞死)是內源性的危險信號，將激發(fā)免疫炎癥反應。我們前期研究應用了一種吞噬了凋亡淋巴細胞的imDC，稱之為PUVA-SP DCs，表達不成熟表型，給移植受者輸注這些DC后，能夠誘導受者T細胞的免疫低反應性，可使移植受者CD4+CD25+Foxp3+Treg明顯增加，移植物存活時間明顯延長[2]，提示PUVA-SP DCs具有負向免疫調節(jié)功能。

圖2 PUVA-SP DCs和imDCs在LPS刺激前后IL-10和IL-12表達水平的變化Fig.2 Changes of IL-10 and IL-12 levels secreted by PUVA-SP DCs and imDC in terms of LPS responsiveness

未成熟DC用于誘導耐受的最大缺陷是有可能在受者體內被激活，從而發(fā)揮抗原呈遞作用，PUVA-SP DCs在炎癥情況下是否會被激活非常重要。為此我們比較了PUVA-SP DCs和imDC在LPS刺激前后表型和細胞因子分泌的變化，結果發(fā)現(xiàn)，與imDC相比，LPS刺激后，PUVA-SP DCs表面分子CD80﹑CD86﹑CD40并未顯著升高，說明其功能分子是相對穩(wěn)定的，可以抵制LPS刺激所致的成熟。PUVA-SP DCs可以自發(fā)分泌IL-10，且LPS刺激后，其分泌的IL-10水平要顯著高于imDCs，而受LPS刺激后，PUVA-SP DCs卻分泌低水平的IL-12，遠遠低于imDCs受刺激后的分泌量，提示其具有下調免疫應答的能力。由此我們認為，PUVA-SP DCs雖然表達不成熟表型，但其功能卻不同于imDC，對LPS的刺激呈耐受狀態(tài)，從而適用于體內誘導免疫耐受。

[1] Beriou G, Moreau A, Cuturi MC. Tolerogenic dendritic cells:applications for solid organ transplantation[J]. Curr Opin Organ Transplant, 2012, 17(1): 42-47.

[2] Zhao YW, Shi ZW, Liu QY. Immunomodulatory effect and its mechanism of triepoxide on regulatory dendritic cells[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(10): 962-965. [趙軼雯, 史振偉, 劉慶陽.雷公藤甲素對調節(jié)性樹突細胞的免疫效應及其機制研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2012, 37(10): 962-965.]

[3] Li F, Lu JY, Liu Q. Effect of MARCH1 on MHC-Ⅱubiquitination of splenic dendritic cells during multiple organ dysfunction syndrome in mice[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(5): 455-458. [李菲, 陸江陽, 劉茜. MHC-Ⅱ類分子泛素化作用的MARCH1在多器官功能障礙綜合征病程中對脾臟樹突細胞研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2012, 37(5): 455-458.]

[4] Zheng DH, Dou LP, Wei YX, et al. Uptake of donor lymphocytes treated with 8-methoxypsoralen and ultraviolet A light by recipient dendritic cells induces CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells and down-regulates cardiac allograft rejection[J].Biochem Biophys Res Commun, 2010, 395(4): 540-546.

[5] Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor[J]. J Exp Med, 1992, 176(6): 1693-1702.

[6] Reichardt W, Durr C, von Elverfeldt D, et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation[J]. J Immunol, 2008, 181(7): 4770-4779.

[7] Lan YY, Wang Z, Raimoni G, et al. "A lternatively activated "dendritic cells preferentially secrete IL-10, expand Foxp3+CD4+T cells, and induce long-term organ allograft survival in combination with CTLA4-Ig[J]. J Immunol, 2006, 177(9): 5868-5877.

[8] Peche H, Trinite B, Martinet B, et al. Prolongation of heart allograft survival by immature dendritic cells generated from recipient type bone marrow progenitors[J]. Am J Transplant,2005, 5(5): 255- 267.