郭 娜，郭英華，蘇龍翔，王雅娟，劉 巖，姜學(xué)革，劉長庭

中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京 100853

肺動脈高壓是一種臨床常見病癥，病因復(fù)雜、治療困難、預(yù)后差，嚴重威脅著患者健康，影響患者生活質(zhì)量。低氧引起血管內(nèi)皮細胞損傷，血管內(nèi)皮合成和分泌的各種血管舒縮因子平衡失調(diào)導(dǎo)致早期肺血管收縮和后期的肺血管重塑，是導(dǎo)致肺動脈高壓的一個重要機制［1］。因此，提高肺血管內(nèi)皮細胞對缺氧耐受性、增加損傷后存活率、改善其功能，是防止缺氧導(dǎo)致的肺動脈高壓發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor，HGF)是一種特異的促內(nèi)皮細胞生長因子，能提高細胞生物學(xué)功能及對抗致病因素損傷［2-3］。有研究表明，HGF具有強大的促血管生成作用，在肺的形成和肺結(jié)構(gòu)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。在利用腹腔注射野百合堿構(gòu)建的大鼠肺動脈高壓模型中，HGF能靶向作用于肺小動脈并阻止肺動脈高壓進展，當(dāng)肺動脈高壓引起肺血管損傷時，肺內(nèi)HGF mRNA水平和蛋白濃度下降，而血漿中HGF的水平在第4、第7和第14天代償性升高［4-5］，可見HGF對于保護肺血管是必須的。雖然目前已有研究均表明HGF對于血管內(nèi)皮細胞具有保護作用，但在肺微血管內(nèi)皮缺氧損傷方面尚未有實驗證實。本研究通過HGF作用于缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細胞 (human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs)后，觀察損傷后HPMECs的存活率、體外培養(yǎng)時細胞的貼壁能力，檢測細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表達的改變，旨在為探索缺血性肺動脈高壓的發(fā)病機制及藥物治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

主要材料和試劑 HPMECs細胞株購自美國Sciencell公司，ECM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，澳洲胎牛血清購自瑞士Lonza公司，胰酶購自美國Sciencell公司，人重組肝細胞生長因子 (rhHGF)購自美國Peprotechasia公司，PHA665752購自美國Selleck公司，兔抗人vWF抗體購自美國Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG、ICAM-1抗體和二抗兔抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購自三洋公司。

HPMECs體外培養(yǎng) HPMECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，500 ml ECM培養(yǎng)基中添加青霉素/鏈霉素5000 U，胎牛血清50 ml。每2～3d換液1次，待細胞生長至80%融合時用胰酶消化法，按1∶2(體積比)分瓶傳代，用第6～8代細胞進行實驗。將HPMECs接種在2.55 cm×2.15 cm大小的蓋玻片上，爬片24 h后，換細胞培養(yǎng)液1次，待其生長至30%融合時進行實驗。HPMECs在37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

HPMECs的鑒定 將第7代HPMECs接種在2.55 cm×2.15 cm大小的蓋玻片上，待其生長至30%融合時取出蓋玻片，PBS漂洗3次，每次5 min，4%(體積分數(shù))多聚甲醛固定30 min后再以PBS漂洗 (方法如前)，隨后用0.2%(體積分數(shù))TritonX-100通透細胞2 min并用山羊血清封閉20 min后，加入兔抗人vWF(體積比1∶50)，室溫下一抗孵育2 h后4℃過夜。次日用PBS漂洗3次，加入FITC標記的二抗 (體積比1∶50)室溫下孵育1 h，最后用甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

構(gòu)建缺氧損傷模型 按實驗分組處理細胞并待細胞貼壁后，將細胞放入特制容器中，容器外接兩根管道，其中一根管道進氣，另一根管道出氣，向進氣口中持續(xù)通入含5%CO2、0～5%(體積分數(shù))O2的混合氣體，并將出氣口通入水中防止外界O2進入容器中，容器其他部位均密封。將容器放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度，實時監(jiān)測容器中實際溫度，保證容器中溫度為 (37±2)℃。

rhHGF對HPMECs存活率的影響 選擇4～7代細胞，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，以2×103個/孔的密度接種于96孔板上，次日換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，隨后按實驗設(shè)計分4組:第1組為空白對照組，細胞于37℃、5%CO2、常規(guī)O2培養(yǎng);第2組為陰性對照組，細胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培養(yǎng);第3組為HGF組，向細胞培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的 HGF(10、30、50、80、100μg/L)，將細胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培養(yǎng);第4組為PHA組 (HGF阻斷劑組)，向細胞培養(yǎng)基中加入濃度為5 μmol/L的HGF阻斷劑PHA665752，將細胞于37℃、5%CO2，0～5%O2下培養(yǎng)。24 h后向各實驗組中加入 MTT溶液 (質(zhì)量濃度 5 g/L)20 μl，37℃下孵育4 h后吸除上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。在酶標儀上以490 nm波長測定各孔光密度 (D)值。存活率=(D實驗組－D空白對照組)/D空白對照組×100%。每組設(shè) 3 個復(fù)孔，重復(fù)3次。

rhHGF對HPMECs體外培養(yǎng)貼壁能力的影響選擇4～7代細胞，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104個/ml，將細胞懸液500 μl接種在24孔板中，按實驗分組，分別設(shè)立空白對照組、陰性對照組、HGF組 (50μg/L)和 PHA665752(5 μmol/L)組。37℃、5%CO2培養(yǎng)1 h后棄去上清液，隨機選取3個高倍鏡視野 (200倍)計數(shù)貼壁細胞，每個組各設(shè)3個復(fù)孔。

rhHGF對HPMECs表達ICAM-1的影響 選擇4～7代細胞，將細胞培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁生長至80%融合后，更換無血清培養(yǎng)基，每瓶3 ml，饑餓培養(yǎng)24 h后，按實驗分組處理細胞，分別設(shè)立空白對照組、缺氧損傷組、HGF組 (50μg/L)和PHA665752(5 μmol/L)組，向培養(yǎng)瓶中加入等體積 (4 ml/瓶)的添加干預(yù)成分的細胞培養(yǎng)基，待培養(yǎng)24 h后按照RIPA法提取蛋白，隨后采用Western blot法檢測ICAM-1的表達。采用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫化學(xué)發(fā)光，拍照，Quantity one軟件進行條帶灰度分析。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用ANOVA檢驗，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

HPMECs的體外培養(yǎng)和鑒定 體外HPMECs能穩(wěn)定傳代，細胞傳代時經(jīng)胰蛋白酶消化后成圓球形，吹打后可從培養(yǎng)瓶壁上脫落，12 h后細胞可貼壁，細胞形態(tài)學(xué)特征見圖1～2。

圖1 人肺微血管內(nèi)皮細胞在普通光學(xué)顯微鏡下成像 (×100)Fig 1 Normal human pulmonary microvascular endothelial cells under the ordinary optical microscope(×100)

圖2 人肺微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)FITC-vWF染色后，同一視野熒光顯微鏡下成像 (×100)Fig 2 The fluorescent microscopy of human pulmonary microvascular endothelial cells after stained with fluorescein isothiocyanate conjugated rabbit anti-vWF antibody(×100)

構(gòu)建缺氧損傷模型 所構(gòu)建缺氧損傷模型，保證除氧氣體積分數(shù)以外的其他條件 (CO2體積分數(shù)、溫度、濕度等)與空白對照組一致。

細胞存活率檢測結(jié)果 10、30、50、80、100μg/L HGF組的細胞存活率分別為0.528±0.029、0.521±0.021、0.518±0.021、0.518±0.021、0.513±0.019，均明顯高于缺氧損傷組的－0.171±0.032(P均＜0.01)，但各HGF濃度組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P均＞0.05);當(dāng)用HGF阻斷劑PHA665752(5 μmol/L)干預(yù)后，其細胞存活率為－0.274±0.050，明顯低于缺氧損傷組和各HGF濃度組 (P均＜0.01)。

HPMECs貼壁率的測定結(jié)果 按實驗分組處理細胞后，隨機選取3個高倍鏡視野計數(shù)貼壁細胞，結(jié)果顯示缺氧損傷組細胞貼壁率為7.111±2.369，明顯低于50μg/L HGF組的17.111±3.790(P ＜0.001)，明顯高于PHA組的2.556±1.944(P＜0.001)，與空白對照組的8.667±2.121差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。

ICAM-1表達的測定結(jié)果 按實驗分組處理細胞后，提取蛋白，檢測ICAM-1的表達，結(jié)果顯示缺氧損傷組、50μg/L HGF組和PHA組的ICAM-1表達量分為1.141±0.072、1.123±0.134和1.267±0.248，均明顯高于空白對照組的0.671±0.119(P均 ＜0.01)，50μg/L HGF組和 PHA 組的 ICAM-1表達量均明顯低于缺氧損傷組 (P均＜0.01)。

討 論

目前，肺動脈高壓的治療雖然取得較大進展，但是病死率仍然很高，而且并不能達到完全治愈的目的。肺移植術(shù)雖然可達到根治目的，但基于其移植供體不易獲得、排異反應(yīng)以及費用高等缺陷，僅能有少數(shù)患者獲益。因此，無論是對于臨床工作還是科學(xué)研究，開發(fā)有效的治療藥物都是必須的。

HGF又稱擴散因子，是由相對分子質(zhì)量為69×103的α亞基和34×103的β亞基通過二硫鍵組成的有活性的異源二聚體［6］，細胞膜表面的 c-Met蛋白是HGF的特異性受體，PHA665752是c-Met受體抑制劑，可以抑制其生物學(xué)作用［7］。有研究表明，HGF通過與c-Met受體結(jié)合，催化底物蛋白的磷酸化，將細胞外的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)部，構(gòu)成HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，HGF可以刺激多種不同類型的細胞發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，主要包括:促進牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增生和移行［8］、促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和毛細血管形成［9-11］、促進臍靜脈內(nèi)皮細胞合成NO從而增強內(nèi)皮細胞的活力［12］、促進干細胞的定向移動并誘導(dǎo)其分化為血管內(nèi)皮細胞［13］。本研究采用HGF作用于缺氧損傷的HPMECs，觀察損傷后HPMECs存活率、體外培養(yǎng)時細胞的貼壁能力及檢測ICAM-1表達的改變，以期從細胞水平進一步探討HGF對缺氧損傷HPMECs的保護作用，為探索缺血性肺動脈高壓的發(fā)病機制和藥物治療提供實驗依據(jù)。

血管內(nèi)皮的完整性不僅依賴于減少細胞死亡，更重要的在于保持血管內(nèi)皮細胞增殖與細胞死亡的動態(tài)平衡，因此，有效提高內(nèi)皮細胞的存活率有利于損傷內(nèi)皮修復(fù)。研究表明，HGF可促進臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖［9］，同時在HGF作用下，肺癌細胞A549形成的病灶具有明顯的毛細血管誘生作用［10］。本研究中，HGF可以顯著提高缺氧損傷HPMECs的存活率，當(dāng)用HGF特異性受體阻斷劑PHA665752阻斷HGF作用后，細胞存活率較HGF干預(yù)組和缺氧損傷組顯著下降，可見HGF是有效的促進HPMECs增殖的細胞因子，對于缺氧損傷后HPMECs起到保護作用，提高了損傷后HPMECs存活率，同時，一旦HGF通路被抑制后，細胞不僅不能正常增殖，其損傷程度將進一步加重，存活率較單純損傷組顯著下降。

以往大量研究發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)過程中，細胞狀態(tài)良好時，細胞貼壁的效率高，細胞貼壁后形態(tài)更加規(guī)則，細胞與細胞之間的差異性更小。國內(nèi)外學(xué)者運用體外差速貼壁法來分離純化細胞，細胞的貼壁速度與物理性狀和成熟度密切相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧損傷時HPMECs貼壁能力較空白對照組有所下降;HGF干預(yù)后，HPMECs的貼壁能力較缺氧損傷組明顯增強;用特異性阻斷劑PHA665752阻斷HGF的作用后，HPMECs貼壁能力明顯下降。由此可見，HGF使HPMECs處于良好的生長狀態(tài)下，為細胞生長提供了適宜的微環(huán)境，內(nèi)皮細胞本身也可以分泌少許的HGF，當(dāng)阻斷HGF通路后，細胞貼壁率下降，細胞的生長狀態(tài)受到影響。HGF對于保證HPMECs正常生長是必須的，并且在給予外源性HGF后其貼壁率較正常對照組升高。

ICAM-1是一種免疫球蛋白超家族類的細胞表面黏附分子，基因定位于19號染色體上，在血管內(nèi)皮細胞上表達最強，是活化血管內(nèi)皮細胞表達的重要黏附分子［15］。ICAM-1是炎癥反應(yīng)的可信標志物［16］，在細胞表面的表達量可反映損傷病變的嚴重程度［17］。同時，ICAM-1作為重要炎性介質(zhì)在肺部炎癥反應(yīng)中起重要作用，其表達水平與肺損傷程度密切相關(guān)［18］。已有研究表明，ICAM-1促進多型核白細胞在肺內(nèi)聚集并刺激其釋放彈性蛋白酶和其他水解酶，加重肺組織損傷［19］，因此，通過下調(diào)ICAM-1的表達水平來減輕肺損傷是一種行之有效的方法。本研究結(jié)果顯示，正常HPMECs有少量ICAM-1表達，缺氧損傷時ICAM-1的表達量較空白對照組明顯升高，HGF可抑制ICAM-1表達，當(dāng)HGF作用被阻斷后，ICAM-1表達升高，說明HGF可以抑制HPMECs表面炎癥介質(zhì)表達，抑制損傷發(fā)生。

綜上，本研究從細胞水平探討了HGF對缺氧損傷HPMECs的保護作用，缺氧損傷過程中，炎癥反應(yīng)標志物ICAM-1被激活，引起HPMECs結(jié)構(gòu)和功能的損傷，使細胞增殖能力受損，貼壁能力下降。HGF通過抗炎癥因子作用 (包括減少ICAM-1的表達)而增加了HPMECs存活率，提高體外培養(yǎng)時細胞的貼壁率，從而減輕缺氧損傷所造成的HPMECs損傷，對肺動脈高壓的防治發(fā)揮了重要的作用。

［1］Semenza GL.Hypoxia-inducible factor 1:oxygen homeostasis and disease pathophysiology ［J］.Trends Mol Med，2001，7(8):345-350.

［2］Kitta K，Day RM，Ikeda T，et al.Hepatocyte growth factor protects cardiac myocytes against oxidative stress-induced apoptosis［J］.Free Radic Biol Med，2001，31(7):902-910.

［3］Zhou YJ，Wang JH，Zhang J.Hepatocyte growth factor protects human endothelial cells against advanced glycation end products-induced apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，344(2):658-666.

［4］Togo S，Sugiura H，Nelson A，et al.Hepatic growth factor(HGF)inhibits cigarette smoke extract induced apoptosis in human bronchial epithelial cells［J］.Exp Cell Res，2010，316(20):3501-3511.

［5］Myerburg MM，Latoche JD，McKenna EE，et al.Hepatocyte growth factor and other fibroblast secretions modulate the phenotype of human bronchial epithelial cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292(6):L1352-L1360.

［6］Ware LB，Matthay MA.Keratinocyte and hepatocyte growth factors in the lung:roles in lung development，inflammation，and repair［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，282(5):L924-L940.

［7］Crosswell HE，Dasgupta A，Alvarado CS，et al.PHA665752，a small-molecule inhibitor of c-Met，inhibits hepatocyte growth factor-stimulated migration and proliferation of c-Metpositive neuroblastoma cells［J］.BMC Cancer，2009，9:411.

［8］黃瑤，李立，湯永強.肝細胞生長因子對牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的促增生移行效應(yīng) ［J］.眼科研究，2006，24(1):50-53.

［9］韓振國，王巖，李國棟.肝細胞生長因子/擴散因子和血管內(nèi)皮生長因子對腫瘤血管再生的影響［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2004，30(3):376-378.

［10］Scarpino S，D'Alena FC，Di Napoli A，et al.Papillary carcinoma of the thyroid:evidence for a role for hepatocyte growth factor(HGF)in promoting tumour angiogenesis ［J］.J Pathol，2003，199(2):243-250.

［11］Gerritsen ME，Tomlinson JE，Zlot C，et al.Using gene expression profiling to identify the molecular basis of the synergistic actions of hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor in human endothelial cells［J］.Br J Pharmacol，2003，140(4):595-610.

［12］Purdie KJ，Whitley GS，Johnstone AP，et al.Hepatocyte growth factor-induced endothelial cell motility is mediated by the upregulation of inducible nitric oxide synthase expression［J］.Cardiovasc Res，2002，54(3):659-668.

［13］郭英華，劉長庭，何建國.粒細胞集落刺激因子聯(lián)合攜帶肝細胞生長因子基因的BMSCs移植對心肌梗死大鼠血管重建的影響 ［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2011，25(6):736-740.

［14］車曉霞，郭杰，任超超，等.體外培養(yǎng)成肌細胞貼壁速度與細胞物理性狀及成熟度間的關(guān)系［J］.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(6):775-779.

［15］張建初，張曉菊，楊衛(wèi)兵，等.紅花含藥血清對缺氧復(fù)氧條件下大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞P-選擇素及ICAM-1表達的影響 ［J］.中國病理生理雜志，2007，23(9):1845-1849.

［16］周子鑫，韓莉莉，鄭文賀，等.缺氧誘導(dǎo)因子-1對大鼠缺血再灌注損傷后急性炎癥應(yīng)答的影響［J］.中外醫(yī)療，2009，28(22):51-53.

［17］Kumasaka T，Quinlan WM，Doyle NA，et al.Role of the intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)in endotoxin-induced pneumonia evaluated using ICAM-1 antisense oligonucleotides，anti-ICAM-1 monoclonal antibodies，and ICAM-1 mutant mice ［J］.J Clin Invest，1996，97(10):2362-2369.

［18］Li PC，Chen WC，Chang LC，et al.Substance P acts via the neurokinin receptor 1 to elicit bronchoconstriction，oxidative stress，and upregulated ICAM-1 expression after oil smoke exposure［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(5):L912-L920.

［19］羅行，繆長虹，戈寶學(xué)，等.異氟醚和七氟醚及地氟醚對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響［J］.浙江大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，39(5):464-469.