盧文藝，趙明峰，Sajin Rajbhandary，趙 楠，謝 芳，肖 霞，穆 娟，李玉明

天津醫(yī)科大學一中心臨床學院 天津市第一中心醫(yī)院血液科，天津 300192

鐵過載是指由于大量鐵在體內過度沉積而導致心、肝、胰等重要臟器結構受損、功能障礙［1］。大量臨床資料已經證明鐵過載可損傷骨髓的造血功能，近期又有研究報道這可能是由于鐵誘導的大量活性氧 (reactive oxygen species，ROS)影響造血干細胞和祖細胞的功能［2-7］。目前尚不清楚鐵過載對骨髓微環(huán)境有無影響。作為骨髓微環(huán)境的重要成分，間充質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)可通過分泌多種細胞因子和生長因子，形成非造血基質組織來支持骨髓造血，鐵過載有可能通過影響MSCs來損傷骨髓的造血功能。本研究觀察了鐵過載后MSCs增殖及凋亡的變化，并探索其相關機制，試圖找到治療鐵過載疾病的新的突破點。

材料和方法

主要試劑、設備和骨髓標本 低糖DMEM培養(yǎng)基(L-DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司，FACSCalibur流式細胞儀及鼠抗人單克隆抗體CD34、CD45、CD90抗體均為美國BD公司產品，枸櫞酸鐵銨 (ferric ammonium citrae，FAC)購自美國Sigma公司，ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，AnnexinV-FITC流式細胞術檢測試劑盒購自上海美季公司，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，P-p38MAPK)、p38MAPK兔單抗均購自美國Cell Signaling Technology公司，p53兔多抗購自美國Santa Cruz Technology公司，α-微管蛋白兔單抗購自美國Epitomics公司，辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，HRP)標記的鼠抗兔抗體購自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，多功能酶標儀為美國 BioTek公司產品，TH4-200型熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品。

骨髓標本取自天津市第一中心醫(yī)院胸外科非血液病患者手術切除的未受累肋骨，肝素抗凝。

MSCs的培養(yǎng)及鑒定 取新鮮骨髓液4 ml，用淋巴細胞分離液分離提取單核細胞層，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次。用完全培養(yǎng)液 (含15%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)液)調整細胞密度至1×106/ml，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5 d后已有少量細胞貼壁呈梭形，首次全量換液，去除未貼壁細胞，以后每3 d換液一次。培養(yǎng)14 d后，細胞融合率達到80%～90%，用含0.1%乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化細胞，并按1∶2進行傳代，取3～5代的MSCs進行后續(xù)實驗。MSCs的純度通過流式細胞儀免疫標記法 (CD34、CD45、CD90)鑒定。

鐵過載模型的建立及鑒定 用PBS溶解的FAC提供Fe3+離子，向實驗組細胞的培養(yǎng)液內加入不同濃度的FAC(100、200、400 μmol/L)培養(yǎng)12、24、48 h后觀察細胞生長狀態(tài)，消化細胞后行臺盼藍染色。根據此步驟結果選取FAC的最佳作用濃度和時間來處理MSCs，利用不穩(wěn)定鐵可以淬滅鈣熒光素乙酰氧基甲酯(calcein-acetoxymethylester，calcein-AM)的原理，依據參考文獻［8］的方法檢測細胞內不穩(wěn)定鐵池 (labile iron pool，LIP)的含量:用胰酶消化細胞，PBS洗滌2次后重懸細胞于PBS中，加入calcein-AM，使其終濃度為0.125 μmol/L，37℃避光溫育15 min，用PBS洗滌2次后，采用流式細胞儀檢測細胞的平均熒光強度值 (mean fluorescence intensity，MFI)。

ROS的測定 2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽 (dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)為非熒光脂類可滲透性成分，能被細胞內的ROS氧化生成非滲透性熒光成分DCF，故DCF的熒光強度與細胞內ROS水平成正比。本實驗采用參考文獻 ［9］的方法，在此基礎上略加改進:將MSCs以1×105/ml的密度接種于六孔板上，分別加入100、200、400 μmol/L FAC處理細胞后，PBS洗滌2次，加入 DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L，處理細胞15 min后洗滌3次，直接在熒光顯微鏡下觀察各組熒光的強弱。每孔加入細胞裂解液700 ul，37℃搖床裂解細胞10 min后將混勻的裂解液加入到96孔板中，用熒光酶標儀檢測熒光強度 (激發(fā)波長為488 nm，吸收波長為530 nm)，結果采用Gene5軟件進行分析。

MSCs的群體倍增時間 取對數生長期的MSCs，以4×104/孔的密度接種于12孔板上，在37℃溫箱中培養(yǎng)，當細胞達到80%～90%融合時，用胰酶消化傳代。按以下公式計算MSCs的倍增時間 (doubling time，DT):DT=CT×log2/log(X1/X0)，其中X0是細胞最初的數量，X1是細胞最終的數量，CT是細胞培養(yǎng)時間。

Annexin V-PI雙標法檢測細胞凋亡 按照試劑盒說明進行操作，用不含EDTA的胰酶消化MSCs，用PBS洗滌細胞2遍，懸于結合緩沖液，調整細胞密度至1×106/ml。取400 μl細胞懸液于流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC 4℃避光孵育15 min后，再加入10 μl碘化丙啶 (propidium iodide，PI)在4℃下避光孵育5 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

Western blot檢測 收集1×106個 MSCs，用預冷的PBS洗滌2遍，冰上裂解細胞，提取總蛋白。將提取的蛋白以30～100μg的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚二氟乙烯膜上，用含5%牛血清蛋白的TBST緩沖液室溫封閉1 h后，4℃過夜，分別孵育兔單抗AKT、P-p38MAPK、p38MAPK、α-微管蛋白 (1∶1000)和兔多抗p53(1∶250)，洗膜后室溫下以 HRP-鼠抗兔抗體 (1∶5000)孵育2 h?？乖贵w復合物采用增強化學發(fā)光法顯色，暗室X膠片曝光后采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值，將目的蛋白與內參α-微管蛋白的灰度值比值作為相對表達水平行半定量分析。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

MSCs的形態(tài)及免疫表型 原代培養(yǎng)的MSCs最初呈圓形，24 h后開始有少量細胞貼壁，培養(yǎng)5 d后貼壁細胞明顯增多，呈梭形。培養(yǎng)14 d后細胞達到完全融合，以1∶2比例傳代，傳3代后細胞形態(tài)均一，呈纖維漩渦狀貼壁生長 (圖1)。經流式細胞儀直接免疫標記法檢測，發(fā)現第3代的MSCs中極少細胞表達CD34、CD45(陽性率分別為1.45%、1.1%)，絕大多數細胞表達 CD90(陽性率為96.97%)，MSCs的純度較高 (圖2)。

鐵過載模型的鑒定 FAC處理濃度為400 μmol/L、時間為24 h時活細胞在95%以上，繼續(xù)加大鐵濃度和作用時間，活細胞比例下降，故選用此條件進行LIP測定。結果顯示，加鐵組MSCs的MFI較對照組明顯減弱 ［(482.49±20.96)比 (303.88±23.37)，P＜0.05］，因此加鐵組細胞內LIP水平明顯升高 (圖3)。

圖1 MSCs形態(tài)學觀察結果 (×200)Fig 1 Morphology of MSCs(×200)

圖2 MSCs免疫表型鑒定結果Fig 2 Results of immunophenotying of MSCs

圖3 MSCs細胞內的LIP表達水平Fig 3 Levels of intracellular LIP in MSCs

鐵過載增加MSCs內ROS的生成 用不同濃度的 FAC(100、200、400 μmol/L)處理 MSCs 24 h后，熒光顯微鏡觀察到加鐵組熒光強度比對照組增強 (圖4)。采用熒光酶標儀對MSCs內ROS進行的定量檢測也發(fā)現鐵過載組的ROS比對照組明顯增加，且ROS隨著鐵濃度的增加而增加 (圖5)。

鐵過載抑制MSCs增殖、誘導其凋亡 結果顯示，對照組的MSCs生長旺盛，符合MSCs的生長特性，而鐵過載的MSCs增殖能力明顯下降。對照組的DT為 (1.20±0.05)d，加鐵處理12、24、48 h組的DT分別為 (1.47±0.11)、(1.80±0.13)、(2.04±0.14)d，鐵過載組MSCs的DT明顯長于對照組 (P均＜0.05)。Annexin V-PI雙標法顯示鐵過載組MSCs的凋亡率明顯高于對照組的凋亡率 ［(3.51%±1.17%)比 (0.66% ±0.62%)，P＜0.05，圖6］。

鐵過載MSCs的p38MAPK-p53信號途徑被激活鐵過載組MSCs凋亡相關蛋白P-p38MAPK、p38MAPK、p53的表達明顯高于對照組 (P均＜0.05)，而細胞生存相關蛋白AKT的表達無統(tǒng)計學差異 (圖7、表1)。

圖4 鐵過載對MSCs內ROS水平的影響(DCFH-DA，×100)Fig 4 Effect of iron overload on ROS fluorescence level in MSCs(DCFH-DA， ×100)

圖5 熒光酶標儀測定量分析ROS熒光值Fig 5 Quantification assays of the ROS level by fluorescence plate reader

圖6 鐵過載對MSCs凋亡的影響Fig 6 Effect of iron overload on the apoptosis of MSCs

圖7 鐵過載增加了MSCs內p38MAPK、p53信號傳導因子的表達Fig 7 Iron overload augmented the expression of p38 MAPK and p53 in MSCs

表 1 Western blot檢測結果 (n=3，)Table 1 Results of Western blot analysis(n=3，)

表 1 Western blot檢測結果 (n=3，)Table 1 Results of Western blot analysis(n=3，)

P-p38MAPK:磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶;AKT:蛋白激酶B;與對照組比較，aP＜0.05P-p38MAPK:phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase;AKT:protein kinase B;aP＜0.05 compared with the control group

組別 Group P-p38MAPK/α-微管蛋白 P-p38MAPK/α-tublin p38MAPK/α-微管蛋白 p38MAPK/α-tublin AKT/α-tublin p53對照組Control group 0.202±0.024 0.637±0.013 0.721±0.009 0.084±0.011鐵過載組FAC group 0.346±0.040a 0.746±0.026a 0.689±0.023 0.978±0.071a

討 論

鐵過載是一種臨床常見病，多見于遺傳性血色病等遺傳因素及紅系無效造血、長期輸血等繼發(fā)因素造成的機體內鐵吸收過多及代謝障礙。多項研究表明鐵過載患者的骨髓功能明顯抑制，而給予去鐵治療后部分患者血象可恢復正常，能不依賴輸血而長期存活［2］。本研究組的前期研究發(fā)現，鐵過載的骨髓和臍血造血細胞內ROS明顯升高，細胞凋亡比例增加，造血功能明顯下降，造血干/祖細胞比例減低，而這些損傷都可以通過去鐵治療和抗氧化劑治療部分緩解［3-6］。進一步深入研究發(fā)現，鐵過載不僅影響骨髓造血細胞的功能，對MSCs也有明顯的影響。鐵過載可提高MSCs內的ROS水平，抑制MSCs增殖、誘導其凋亡，且這些作用可能與p38MAPK-p53信號通路的激活相關。

在體外培養(yǎng)MSCs時給予不同濃度的FAC來提供游離的Fe3+，鐵可通過與細胞膜上的鐵轉運蛋白結合進入到細胞內［10］，calcein-AM熒光染料染色法顯示鐵過載細胞內LIP的水平明顯升高。胞漿內聚集的大量自由鐵能轉運到線粒體，通過Fenton反應和Haber-Weiss途徑催化生成大量 ROS［11］。本研究利用DCFH-DA探針檢測了鐵過載MSCs內的ROS，發(fā)現細胞內ROS水平和FAC的濃度成正相關，說明本研究建立的MSCs鐵過載模型可誘導ROS的生成，進一步證實了鐵過載與氧化應激的關系。

ROS可通過多種信號途徑抑制MSCs的增殖，誘導其衰老凋亡［12］。許多研究表明，p38MAPK信號途徑參與了ROS介導的MSCs損傷過程，它可通過下調細胞周期蛋白、上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子等機制抑制細胞周期由G1向S及由G2向M過渡，從而使MSCs的增殖能力下降［13］。經線粒體途徑和內質網應激激活的p38MAPK還可調節(jié)Bax的轉移和細胞色素C的釋放，從而誘導骨髓MSCs的凋亡［14］。與此過程密切相關的另一個信號因子是p53，該信號因子可被p38MAPK激活，進而作用其下游靶點p21Cip1使細胞周期停滯，最終降低MSCs的增殖能力，p53還可通過調控促凋亡因子和凋亡因子來誘導 MSCs的凋亡［15］。

本研究發(fā)現，處于氧化應激狀態(tài)下的鐵過載組MSCs增殖活性明顯受抑，凋亡率明顯增加，可見該作用很有可能與鐵催化產生的大量ROS有關。本實驗進一步研究ROS相關信號通路發(fā)現，鐵過載的MSCs內P-p38MAPK、p38MAPK蛋白的表達高于對照組，p53的表達也升高，提示p38MAPK-p53途徑可能參與了鐵過載對MSCs增殖的抑制及對MSCs凋亡的誘導。AKT信號途徑在ROS對MSCs的影響中也起著重要作用，磷酸化的AKT可以激活Bcl-2抗凋亡蛋白，增強MSCs的抗凋亡能力［16］。但是，本研究并未觀察到AKT蛋白的表達有明顯變化，有可能是因為在不同的應激條件下，不同的細胞內ROS可激活不同的信號途徑，而升高的ROS在該過程中并未激活AKT來增加細胞的抗凋亡能力。還有一種可能是，ROS僅僅通過提高磷酸化的AKT來發(fā)揮作用，所以本研究中總AKT蛋白的表達并無明顯變化。

ROS是否參與鐵過載對骨髓微環(huán)境的影響以及p38MAPK、p53信號通路是否介導了MSCs的損傷仍需要進一步研究，通過抗氧化治療、去鐵治療、靶向特異的信號傳導因子及體內研究可進一步探究其機制。研究鐵過載對造血微環(huán)境的影響不僅有助于發(fā)現臨床治療鐵過載疾病的新方法 (抗氧化治療)，也對研究者提出了一個新的問題:如果鐵過載患者造血功能的下降和MSCs損傷有關，給予細胞治療是否能改善患者的造血功能?目前對這一方面的研究尚處于初步階段，有待進一步探索。

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