向明確，蔡雪飛，張文露，黃愛龍，胡接力

1重慶醫(yī)科大學(xué) 重慶市第九人民醫(yī)院感染科，重慶 400700

2重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400016

乙肝病毒 (hepatitis B virus，HBV)耐藥是目前慢性乙型肝炎治療中的重要問題。HBV耐藥突變主要發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶 (reverse transcriptase，RT)區(qū)，例如RT M204I或M204V能大大降低病毒對拉米夫定(lamivudine，LVD)的敏感性［1］;N236T 或 A181V 則與阿德福韋 (adefovir，ADV)耐藥相關(guān)［2-3］;LVD耐藥突變背景 (M204V+L180M)加上T184、S202或M250相應(yīng)突變，將導(dǎo)致HBV對恩替卡韋 (entecavir，ETV)抵抗［4-5］。

體外藥敏實驗 (或表型分析)是確定HBV RT特定突變與耐藥間關(guān)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于缺乏很好的體外HBV細胞感染系統(tǒng)，目前HBV體外藥敏分析大多依賴這樣一種方式:將合適的HBV DNA重組體轉(zhuǎn)染肝癌細胞系，讓其在體外復(fù)制HBV DNA，再用Southern blot檢測不同濃度藥物作用下HBV DNA復(fù)制量變化［6］。進行HBV體外表型分析時，需從細胞內(nèi)分離純化HBV復(fù)制中間體，并排除轉(zhuǎn)染入細胞的質(zhì)粒HBV DNA對后續(xù)檢測干擾。但以往研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染入細胞的質(zhì)粒DNA在純化過程中往往難以有效及穩(wěn)定地去除，導(dǎo)致影響后續(xù)Southern blot檢測效果。本研究將一源于臨床病毒株的HBV RT區(qū)克隆到HBV 1.1倍體質(zhì)粒上，使其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細胞系，獲得了HBV DNA的體外穩(wěn)定復(fù)制。由于該體系免去了瞬時轉(zhuǎn)染步驟，因而可以徹底去除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒干擾，有助于提高HBV體外表型分析的準確性。

材料和方法

材料 血清來源于1例30歲男性慢性乙型肝炎患者，該患者為核苷 (酸)類似物初治患者，治療開始時，谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (alanine aminotransferase，ALT)108 U/L，血清 HBV DNA 8.9×107copies/ml，HBeAg陽性，接受10 mg/d ADV治療24周后，血清HBV DNA為 6.5×104copies/ml，ALT為 39 U/L。質(zhì)粒p1818-LL為本課題組構(gòu)建［7］，含有 B基因型 HBV 1.1倍基因組DNA，位于巨細胞病毒極早期啟動子(cytomegalovirus immediate-early promoter，CMV)下游，可支持HBV DNA體外復(fù)制。高純度病毒核酸提取試劑盒、地高辛標記檢測試劑盒為Roche公司產(chǎn)品;膠回收純化試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;高保真DNA聚合酶 (PrimeStar HS DNA Polymerease)購自Takara生物技術(shù)公司;內(nèi)切酶 Dpn I、Sma I及Proteinase K、Dnase I為Promega公司產(chǎn)品;表面抗原ELISA檢測試劑盒為上海科華生物技術(shù)公司產(chǎn)品;real-time PCR試劑SsoFast EvaGreen Supermix為Biorad公司產(chǎn)品，所用熒光染料為Eva Green;real-time PCR儀型號為Bio-rad公司IQTM5。

細胞系 HepG2細胞為本室保存，源于美國ATCC(American Type Culture Collection)，用含10%(體積分數(shù))胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的MEM于37℃，5%(體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)。

引物 由英駿 (上海)生物公司合成，引物序列及其在HBV基因組上的對應(yīng)位置見表1。

表1 引物及序列Table 1 Sequences of primers

血清HBV DNA片段擴增 用血清DNA提取試劑盒從患者血清中提取HBV DNA，具體操作按說明書進行。用引物F2270和R1825擴增HBV DNA片段，參數(shù):預(yù)變性94℃ 2 min，循環(huán)條件:94℃ 15 s，52℃10 s，72℃ 2 min 10 s，共35個循環(huán)。以該PCR產(chǎn)物為模板，用引物F55和R1654做巢式PCR，擴增片段55～1654，參數(shù):預(yù)變性94℃ 2 min，循環(huán)條件:94℃ 15 s，60℃ 10 s(－0.5℃ /cycle)，72℃ 1 min 20 s，10個循環(huán);94℃ 15 s，55℃ 10 s，72℃ 1 min 20 s，25 個循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后測序。

55～1654片段置換反應(yīng) 用QIAGEN膠回收試劑盒純化上述PCR片段，電泳定量。取純化后的55～1654片段800 ng做FSR，將源于患者的HBV DNA片段置換到HBV復(fù)制質(zhì)粒pLL對應(yīng)位置。55～1654片段置換反應(yīng) (fragment substitution reaction，F(xiàn)SR)原理見文獻 ［7］。具體如下:建立FSR反應(yīng)體系:dNTPs 0.2 mmol/L，55～1654片段800 ng，pLL 50 ng，PrimeStar DNA 聚合酶 0.5 μl，5 × buffer 10 μl，總體積50 μl。反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性94℃ 2 min;循環(huán)條件:94℃ 15 s，55℃ 10 s，72℃ 4 min 30 s，共18 個循環(huán)，反應(yīng)產(chǎn)物純化后，取部分產(chǎn)物用Dpn I 37℃消化4 h，取消化產(chǎn)物1.5 μl電轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，然后挑克隆，提取質(zhì)粒并測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為p11。

質(zhì)粒p11-neo構(gòu)建 用引物Fneo及Rneo從pEGFP-N1擴增新霉素抗性基因表達片段，包括SV40啟動子、新霉素抗性基因及PolyA信號序列，長度約1.4 kb。該片段用Sma I酶切后克隆到p11質(zhì)粒中HBV DNA下游，候選克隆經(jīng)酶切及測序鑒定，正確者命名為p11-neo。

細胞內(nèi)HBV病毒DNA分析 HepG2細胞用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基在37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前20 h，將HepG2細胞接種于6孔板，密度約為7×105/孔，用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。第2天用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后第5天，按文獻方法從HepG2細胞中提取細胞質(zhì)核心顆粒 HBV DNA［7］，然后用 Southern blot檢測HBV DNA:樣品經(jīng)1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至帶正電荷尼龍膜，烤干固定后進行預(yù)雜交、雜交 (地高辛標記的HBV DNA探針)、洗脫、檢測，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。

穩(wěn)定復(fù)制HBV細胞株的構(gòu)建 將p11-neo用Not I酶切線性化后轉(zhuǎn)染HepG2細胞 (3.5 cm細胞培養(yǎng)皿)，轉(zhuǎn)染后第3天將細胞傳入10 cm培養(yǎng)皿，并用1000 mg/L G418進行篩選3周，此時將剩余細胞用胰酶消化，并以2～3個細胞/孔的密度接種到96孔板，繼續(xù)以500 mg/L G418篩選培養(yǎng)2～3周，每周更換培養(yǎng)基1次，待細胞克隆擴增后用real-time PCR檢測培養(yǎng)上清液中HBV DNA。real-time PCR所用引物為F55及R260，反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 5 min。循環(huán)條件:95℃ 15 s，63℃ 30 s(－1℃ /cycle)，72℃ 20 s，10個循環(huán);94℃ 15 s，51℃ 30 s(本步檢測信號)，72℃ 20 s，30個循環(huán)。DNA定量標準品為p11梯度稀釋品，標準品DNA濃度為6×102～6×106copies/μl。real-time PCR初篩出的克隆繼續(xù)用ELISA檢測上清液中HBsAg表達情況，陽性者繼續(xù)擴大培養(yǎng)后，用Southern blot檢測細胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體。

結(jié) 果

患者血清HBV DNA片段PCR擴增及克隆 本研究的這名患者是一項ADV臨床藥物試驗的參與者，治療24周后，病毒滴度較前期有一定程度下降，為6.5×104copies/ml。首先用巢式PCR從血清HBV DNA擴增出片段nt55～1654(圖1B)，測序結(jié)果顯示，該片段編碼的氨基酸序列中 (結(jié)果未顯示)，未發(fā)現(xiàn)已報道的ADV耐藥相關(guān)突變。接下來，將nt55～1654克隆到 HBV 1.1倍體質(zhì)粒 pLL上。pLL是一個可支持HBV體外復(fù)制的重組體，含有B基因型HBV DNA 1.1倍體 (圖1A)。為了保證克隆了患者HBV DNA的質(zhì)?？蓮?fù)制，需將該nt55～1654替換原質(zhì)粒上的nt55～1654片段，而保留1.1倍體的其他部分，以保證聚合酶、核心蛋白及表面蛋白的正常表達。由于該片段兩側(cè)并無合適酶切位點，本研究采用以往建立的FSR方法 (圖1C)將該片段成功替換到pLL上。

新霉素抗性表達片段克隆 為了后續(xù)建立穩(wěn)定HBV復(fù)制細胞系，需在p11質(zhì)粒上引入抗性篩選基因。從pEGFP-N1上擴增新霉素抗性表達片段，包括SV40啟動子、新霉素抗性基因和PolyA序列，并將該片段克隆到p11上HBV 1.1倍體下游的Sma I位點。圖2為克隆初篩及酶切鑒定結(jié)果，1～3號克隆均含有符合預(yù)期大小的插入片段，測序結(jié)果證實克隆成功。

圖1 患者血清HBV DNA片段PCR擴增及克隆Fig 1 Cloning of the DNA fragment amplified from the patient serum HBV DNA

圖2 p11-neo克隆構(gòu)建Fig 2 Cloning of the neomycin resistance gene expressing fragment to p11

含臨床病毒株RT區(qū)的HBV 1.1倍體可在體外復(fù)制 為驗證含有患者HBV DNA片段的p11-neo是否支持體外復(fù)制，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，分離純化細胞質(zhì)核心顆粒HBV DNA，并用Southern blot檢測。結(jié)果顯示，與陽性對照pLL類似，p11-neo轉(zhuǎn)染細胞后可產(chǎn)生單鏈DNA(ssDNA)及少量雙鏈線性DNA(dslDNA)。盡管在分離純化HBV復(fù)制中間體過程中采用DNase I去除質(zhì)粒DNA，但在Southern blot檢測結(jié)果中仍可見殘余質(zhì)粒 (圖3)，且這些質(zhì)粒信號較強，對真正HBV復(fù)制中間體信號形成一定干擾。

圖3 Southern blot檢測HBV體外復(fù)制Fig 3 Detection of HBV replicative intermediates by Southern blot analysis

real-time PCR結(jié)合ELISA快速初篩穩(wěn)定復(fù)制HBV的細胞克隆 在證明p11-neo可支持HBV復(fù)制后，將其轉(zhuǎn)染HepG2細胞以構(gòu)建穩(wěn)定復(fù)制細胞系。因可復(fù)制HBV的細胞能將病毒顆粒分泌到胞外，據(jù)此利用real-time PCR初篩細胞克隆。為了使病毒富集從而便于檢測，在檢測前1周不更換培養(yǎng)基。檢測時，直接從96孔板中取培養(yǎng)上清液2 μl進行realtime PCR。定量曲線顯示擴增效率偏低 (75.9%)(圖4)。根據(jù)定量結(jié)果，選擇上清液HBV DNA濃度較高 (＞2.8×105copies/ml)的5個細胞克隆進一步做ELISA鑒定。ELISA結(jié)果顯示，這5個細胞克隆中有2個 (克隆3-4和3-10)培養(yǎng)上清中HBsAg表達為強陽性 (D450nm分別為2.213、2.106，陰性對照為0.077)，另3個克隆為陰性或弱陽性。

HBV穩(wěn)定復(fù)制細胞系的鑒定 為最終確定細胞系是否可復(fù)制HBV，將候選細胞克隆擴大培養(yǎng)，然后提取細胞質(zhì)核心顆粒HBV DNA，并用Southern blot法進行檢測。細胞克隆3-10及3-4(圖5及未顯示的結(jié)果)均可見明顯復(fù)制中間體ssDNA，雖然dlsDNA及rcDNA不明顯，但仍足以證明存在HBV復(fù)制。值得注意的是，在樣本檢測泳道，背景較干凈，較高分子量區(qū)域未見含有HBV DNA的質(zhì)?；蚧蚪M信號 (圖 5)。

討 論

圖4 real-time PCR初篩HBV穩(wěn)定復(fù)制細胞系Fig 4 Screening for stable HBV replication cell lines with real-time PCR

圖5 Southern blot檢測細胞系3-10中HBV DNAFig 5 Detection of HBV DNA extracted from cell line 3-10

體外表型分析是HBV耐藥突變研究中常用方法。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，用轉(zhuǎn)染HBV DNA重組體的方法做表型分析時，結(jié)果常不夠穩(wěn)定，原因有兩個:(1)HepG2細胞較難轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染效率較不穩(wěn)定;(2)由于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量較大 (微克)，盡管純化HBV復(fù)制中間體時要用DNase I消化，質(zhì)粒DNA仍不易徹底去除，且不同批次實驗中，質(zhì)粒去除程度也有差異，質(zhì)粒中HBV序列會對目標信號造成不同程度干擾從而影響結(jié)果準確性 (這也是realtime PCR并不適合用來做此類檢測的重要原因，因為無法區(qū)分質(zhì)粒DNA和復(fù)制中間體)。本研究將含有患者HBV RT的HBV 1.1倍重組體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到HepG2細胞，可以解決以上兩種問題，因為穩(wěn)定復(fù)制HBV的細胞系無需再考慮轉(zhuǎn)染效率及去除質(zhì)粒的問題。結(jié)果顯示，在檢測3-10細胞系中HBV復(fù)制中間體時，的確未發(fā)現(xiàn)質(zhì)?；蚧蚪MDNA干擾現(xiàn)象。

在構(gòu)建穩(wěn)定復(fù)制HBV細胞株時，本研究用realtime PCR方法初篩細胞克隆，這有助于較快速鑒定出陽性克隆。若用ELISA初篩，則出現(xiàn)假陽性克隆的可能性較大，因為質(zhì)粒的整合位置可能是隨機的。有的細胞雖可表達HBsAg，但并不復(fù)制HBV，可能是由于質(zhì)粒整合到基因組時，保持了S啟動子及下游S開放閱讀框 (open reading frame，ORF)的完整性，但其他病毒關(guān)鍵成分 (如聚合酶、核心蛋白等)表達遭到破壞。直接在細胞培養(yǎng)上清液中檢測HBV DNA可以避免由于整合部位錯誤導(dǎo)致的假陽性問題，若確定上清液中有HBV DNA，則基本上可判定該細胞克隆能復(fù)制HBV。本研究利用real-time PCR初篩，將候選克隆范圍從96孔板規(guī)模的數(shù)十個迅速縮小到數(shù)個，大大降低了后期細胞克隆擴增篩選的工作量，挑選上清液HBV DNA定量較高且ELISA結(jié)果陽性的2株細胞擴大培養(yǎng)，結(jié)果證明，這2株細胞均可穩(wěn)定復(fù)制HBV。筆者的經(jīng)驗顯示，在用real-time PCR初篩克隆時，需注意細胞數(shù)量不能太少，且檢測前1周不宜更換培養(yǎng)基以富集上清液中的病毒顆粒，另外，由于real-time PCR的靈敏度高，需注意防范污染問題。

臨床HBV病毒株穩(wěn)定復(fù)制細胞系可改善表型分析實驗效果，但其構(gòu)建時間周期較長，筆者認為可能更適合于用來對初步陽性結(jié)果的進一步確認，例如先通過瞬時轉(zhuǎn)染獲得臨床病毒株的初步藥物敏感數(shù)據(jù)，若懷疑為耐藥表型，則可構(gòu)建穩(wěn)定復(fù)制細胞株做進一步鑒定，這樣可能有助于獲得更可靠的結(jié)果。

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