孫 邈，崔 琳，劉衛(wèi)紅，高 原，沈 思，朱明軍，王幼平

1河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及心臟中心，鄭州 450000

2河南中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)，鄭州 450008

高血壓，尤其是鹽敏感性高血壓是造成終末期腎臟病的主要疾病之一［1-3］。大量研究表明以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)在鹽敏感性高血壓所引起的腎臟損害中發(fā)揮重要作用［4］。在病理狀態(tài)下，白細(xì)胞與趨化因子相互作用促使白細(xì)胞滲出并向損傷和炎癥部位聚集，從而形成炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)屬于C-C趨化因子家族。MCP-1與單核/巨噬細(xì)胞表面的C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2，CCR2)相互作用，從而誘發(fā)以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)［5］。實(shí)驗(yàn)研究顯示，通過使用藥物阻斷CCR2受體可明顯抑制多種疾病引起的腎臟損害，其中包括糖尿病引起的腎臟損害［6］。本研究擬在醋酸脫氧皮質(zhì)酮 (desoxycorticosterone acetate，DOCA)-鹽高血壓動物模型上觀察CCR2受體阻斷劑對腎臟功能和形態(tài)學(xué)的影響，以闡明CCR2受體對鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害的影響。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動物及試劑 清潔級雄性C57BL/6小鼠(周齡8～9周)購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2011-0011。CCR2受體阻斷劑 RS504393(Tocris Bioscience，USA)，DOCA 片 (Innovative Research of America，USA)，ELISA尿白蛋白試劑盒 (Exocell，USA);改良的Jaffe肌酐測定試劑盒 (BioAssay System，USA);尿8-異構(gòu)前列腺素 (8-isoprostane)試劑盒 (Ann Arbor，Cayman Chemical公司);大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體 (1∶200，Serotec，UK)，大鼠 IgG(1∶400，Vector Laboratories，USA)。

造模及分組 C57BL/6小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，分為DOCA-鹽高血壓模型組、DOCA-鹽高血壓RS504393組和對照組。DOCA-鹽高血壓小鼠根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的實(shí)驗(yàn)方法［4］制備。方法如下:經(jīng)皮下注射混合麻醉劑 (氯胺酮80 mg/kg+甲苯噻嗪4 mg/kg)麻醉小鼠，常規(guī)切除左側(cè)腎臟，于小鼠頸部皮下植入DOCA片 (Innovative Research of America，USA)，術(shù)后給予含1%NaCl和0.2%KCl的飲用水。DOCA-鹽高血壓模型組給予RS504393的溶媒;DOCA-鹽高血壓RS504393組給予特異性的CCR2受體阻斷劑RS504393(RS504393溶于含有5%二甲基亞砜的生理鹽水，皮下注射，2 mg/kg，每日2次，持續(xù)4周);對照組小鼠僅摘除左側(cè)腎臟，但不植入DOCA片，給予正常飲用水。術(shù)后所有小鼠連續(xù)3d肌肉注射青霉素鈉鹽。實(shí)驗(yàn)共觀察4周。

動脈收縮壓測定 分別于術(shù)前及術(shù)后各周，根據(jù)Tail-cuff體積描記法原理利用BP-2000型血壓測定儀 (Visitech System，USA)測定清醒小鼠尾動脈收縮壓。測定時間為上午10:00～12:00。小鼠在30℃烘箱內(nèi)安靜加熱10 min后，固定器固定，待小鼠穩(wěn)定后連續(xù)測定尾動脈收縮壓5次，取其平均值作為該小鼠動脈收縮壓。

尿樣及血漿分析 于術(shù)后第4周結(jié)束前2 d，將小鼠放入代謝籠，適應(yīng)后收集24 h尿液，稱體重。皮下注射混合麻醉劑麻醉小鼠，經(jīng)腹主動脈采血、離心，收取血漿，保存于－80℃。尿白蛋白用ELISA試劑盒(Exocell，USA)測定;尿及血漿中肌酐濃度用改良的Jaffe肌酐測定試劑盒測定 (BioAssay System，USA);尿8-異構(gòu)前列腺素用Cayman Chemical公司 (Ann Arbor，USA)生產(chǎn)的特異性試劑盒測定。

腎臟病理組織學(xué)分析 摘除右腎、稱重，置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。對4 μm厚石蠟包埋組織切片進(jìn)行過碘酸-雪夫 (PAS)染色和Masson三色染色。由1位不了解實(shí)驗(yàn)情況但具有病理學(xué)知識的人員，根據(jù)文獻(xiàn) ［4］，通過以上兩種染色分別對腎小球纖維樣硬化和腎小管間質(zhì)損傷程度進(jìn)行分析。根據(jù)腎小球硬化范圍、腎小管擴(kuò)張、肥厚、間質(zhì)纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行半定量分析。

免疫組織化學(xué)染色分析 采用卵白素-生物素復(fù)合物技術(shù)對單核/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80進(jìn)行染色。對石蠟包埋組織切片常規(guī)處理后，加入大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體，4℃下孵育12 h，沖洗，然后加入生物素標(biāo)記的抗大鼠IgG(1∶400)，室溫下孵育1 h后加卵白素-生物素復(fù)合物，室溫孵育45 min，最后加入二氨基聯(lián)苯胺顯色液，顯微鏡下觀察控制染色。實(shí)驗(yàn)同時采用正常大鼠血清或去除第一抗體的方法作為陰性對照。根據(jù)文獻(xiàn) ［4］，每張切片隨機(jī)選取15個視野，在高倍鏡 (×400)下對F4/80陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后取其平均值代表單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量。

結(jié) 果

各組小鼠血壓 術(shù)前各實(shí)驗(yàn)組之間基礎(chǔ)血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后對照組小鼠血壓平穩(wěn)，無明顯增加，而術(shù)后第1周模型組和RS504393組小鼠血壓較對照組明顯升高 (P＜0.05)，并且于術(shù)后第3、4周達(dá)高峰。然而，模型組和RS504393組小鼠血壓之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1)。

尿白蛋白排泄量 術(shù)前及術(shù)后觀察期間，各實(shí)驗(yàn)組小鼠之間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組相比，模型組小鼠腎臟/體重比值和24 h尿白蛋白排泄量顯著增加 (P＜0.05)，而肌酐清除率明顯下降(P＜0.05)，RS504393處理可顯著抑制以上變化，使其恢復(fù)正常 (表1)。

尿8-異構(gòu)前列腺素24 h排泄量 尿8-異構(gòu)前列腺素24 h排泄量作為反映腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)，術(shù)后模型組小鼠較對照組小鼠明顯增加 (P＜0.05)，RS504393可明顯抑制其增加 (圖2)。

圖1 各組小鼠收縮壓比較Fig 1 Changes in systolic blood pressure in all groups

圖2 各組小鼠尿8-異構(gòu)前列腺素24 h排泄量Fig 2 Changes in urinary 8-isoprostane excretion over 24-hour period in all groups

表1 各組小鼠體重及腎臟相關(guān)參數(shù)的變化 ()Table 1 Changes in body weight and renal parameters in all groups()

表1 各組小鼠體重及腎臟相關(guān)參數(shù)的變化 ()Table 1 Changes in body weight and renal parameters in all groups()

與假手術(shù)組比較，aP＜0.05;與DOCA-鹽處理組比較，bP＜0.05aP＜0.05 compared with sham group;bP＜0.05，compared with DOCA-salt treated group

分組Group n 體重Weight(g)腎臟重量Kidney weight(mg/g)24 h尿白蛋白排泄量Urinary albumin(μg/24 h)肌酐清除率Creatinine clearance(ml/24 h)假手術(shù)組Sham group 7 28.1±0.9 7.56±0.19 5.7±0.4 336±17 DOCA-鹽處理組 DOCA-salt treated group 8 28.4±1.0 11.09±0.30a 25.6±2.8a 211±13a RS504393處理組 RS504393 group 8 27.7±1.1 8.26±0.27b 7.3±0.9b 306±13b

腎臟病理組織學(xué) 模型組小鼠腎小球可見明顯的纖維樣硬化，其腎小球纖維樣硬化指數(shù)較對照組顯著升高，RS504393處理可抑制其升高，防止鹽敏感性高血壓誘發(fā)的腎小球纖維樣硬化 (圖3)。模型組小鼠腎小管間質(zhì)損傷程度較對照組明顯加重，主要表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張與肥厚、間質(zhì)纖維化及炎性細(xì)胞浸潤等，RS504393處理可抑制上述變化，阻止鹽敏感性高血壓誘發(fā)的腎小管間質(zhì)損傷 (圖4)。

免疫組織化學(xué)染色 F4/80陽性的單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量在模型組小鼠腎臟較對照組小鼠顯著增加，RS504393處理可明顯抑制F4/80陽性的單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量在腎內(nèi)升高，從而阻止鹽敏感性高血壓誘發(fā)的以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的腎內(nèi)炎性反應(yīng) (圖5)。

討 論

本研究顯示通過皮下包埋DOCA和飲用鹽水誘發(fā)的鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害，其主要表現(xiàn)為尿白蛋白增加、肌酐清除率下降、尿8-異構(gòu)前列腺素排泄增加、腎小球纖維樣硬化、腎小管間質(zhì)損傷，其中包括腎小管擴(kuò)張和腎間質(zhì)纖維化以及腎間質(zhì)單核/巨噬細(xì)胞浸潤等。所有這些腎臟功能及形態(tài)學(xué)的變化均被CCR2受體阻斷劑所抑制。表明CCR2受體介導(dǎo)鹽敏感性高血壓誘導(dǎo)的腎臟損害，其機(jī)制可能通過CCR2受體介導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞浸潤。

在高血壓過程中，血壓升高是造成腎臟損害的主要機(jī)制之一［7］。本研究通過使用鼠尾動脈法確定小鼠尾動脈收縮壓，結(jié)果顯示小鼠通過皮下包埋DOCA和飲用鹽水可誘發(fā)鹽敏感性高血壓，阻斷CCR2受體可抑制和改善鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害，但是，CCR2受體阻斷劑并不影響皮下包埋DOCA和飲用鹽水誘發(fā)的鹽敏感性高血壓，兩組小鼠的血壓之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，在鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害過程中，CCR2受體阻斷劑誘導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用結(jié)果主要來源于該阻斷劑對CCR2受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響而非對血壓的影響。表明在鹽敏感性高血壓過程中CCR2受體阻斷劑介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用是獨(dú)立于血壓因素的，并非通過降低血壓而實(shí)現(xiàn)其腎臟保護(hù)作用。

圖3 各組小鼠腎小球纖維樣硬化程度Fig 3 Changes in glomerulosclerosis in all groups

圖4 各組小鼠腎小管間質(zhì)損傷程度Fig 4 Changes in tubulointerstitial injury in all groups

尿白蛋白是反映終末期腎臟疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。本研究通過皮下包埋DOCA和飲用鹽水誘發(fā)的鹽敏感性高血壓在小鼠上造成明顯的白蛋白尿。需要指出的是尿白蛋白的明顯增加卻僅伴隨中等程度的腎小球損害，即尿白蛋白的變化并不平行于光學(xué)顯微鏡觀測到的腎小球的損害。有研究顯示在光學(xué)顯微鏡觀測到腎臟損害之前尿白蛋白就已經(jīng)有明顯增加［8-9］，其機(jī)制在于導(dǎo)致白蛋白尿的腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生在光學(xué)顯微鏡可觀測到的改變之前，表明超微結(jié)構(gòu)的改變，包括腎小球基質(zhì)膜的增厚和足細(xì)胞的退化，都先于光學(xué)顯微鏡下組織形態(tài)學(xué)的改變［10］。大量研究證據(jù)表明腎小球足細(xì)胞損傷與白蛋白尿密切相關(guān)［11］。CCR2受體對鹽敏感性高血壓造成的腎臟超微結(jié)構(gòu)損害的影響有待于進(jìn)一步的研究。

盡管鹽敏感性高血壓造成腎臟損害的具體機(jī)制尚未完全闡明，但有研究已經(jīng)證明炎性反應(yīng)，尤其是以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)在此過程中發(fā)揮重要作用［4，12］。本研究在通過皮下包埋DOCA和飲用鹽水誘發(fā)的鹽敏感性高血壓過程中，腎臟損害伴隨有明顯的單核/巨噬細(xì)胞浸潤［4，13］，提示單核/巨噬細(xì)胞可能在鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害中發(fā)揮重要作用。血中的白細(xì)胞包括單核細(xì)胞在其滲出、移動和分化過程中涉及到多種環(huán)節(jié)和因素，在此過程中趨化因子發(fā)揮重要作用。在各種趨化因子中，MCP-1對單核/巨噬細(xì)胞的滲出和移動發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。MCP-1與單核/巨噬細(xì)胞表面的CCR2受體相互作用促使單核/巨噬細(xì)胞的滲出、移動和分化，從而形成以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)［5］。本研究CCR2受體阻斷劑抑制鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害，該保護(hù)作用同時伴隨有單核/巨噬細(xì)胞浸潤的下降。因此，推測在鹽敏感性高血壓過程中，CCR2受體阻斷劑介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用可能是通過抑制MCP-1與CCR2受體之間的相互作用而減少單核/巨噬細(xì)胞的浸潤，以達(dá)到其腎臟保護(hù)作用。

圖5 各組小鼠F4/80陽性的單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量比較Fig 5 Changes in renal immunostaining of F4/80-positive cells(monocytes/macrophages)in all groups

高血壓介導(dǎo)的腎臟損害往往與單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)［4，14］。浸潤入組織的單核/巨噬細(xì)胞通過多種因素和機(jī)制造成組織損害，其中包括釋放各種細(xì)胞因子、溶酶體酶、一氧化氮和氧自由基等［15］。來自于單核/巨噬細(xì)胞和其他組織細(xì)胞的氧自由基可氧化各種細(xì)胞成分，如:DNA和細(xì)胞膜，從而直接造成組織器官損害。在實(shí)驗(yàn)中，目前通常測定8-異構(gòu)前列腺素以判斷氧化應(yīng)激反應(yīng)程度，從而間接反映體內(nèi)氧自由基水平。本研究結(jié)果顯示，通過皮下包埋DOCA和飲用鹽水誘發(fā)的鹽敏感性高血壓造成腎臟損害，在此過程中同時伴隨有尿中8-異構(gòu)前列腺素排泄的增加。另外，CCR2受體阻斷劑介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用伴隨有單核/巨噬細(xì)胞浸潤的下降及尿中8-異構(gòu)前列腺素排泄的下降。因此，推測在鹽敏感性高血壓過程中，CCR2受體阻斷劑介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用是通過抑制單核/巨噬細(xì)胞功能，而其中機(jī)制之一可能是通過抑制單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自由基，從而達(dá)到其腎臟保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，CCR2受體誘導(dǎo)的以單核/巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)在鹽敏感性高血壓造成的腎臟損害中發(fā)揮著重要作用。在鹽敏感性高血壓過程中，CCR2受體阻斷劑通過抑制單核/巨噬細(xì)胞的浸潤及相關(guān)活性物質(zhì)的產(chǎn)生，如:氧自由基的釋放，從而達(dá)到其腎臟保護(hù)作用。因此，臨床上通過藥理學(xué)方法阻斷CCR2受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為防治鹽敏感性高血壓造成腎臟損害的方法之一，從而減少高血壓，尤其是鹽敏感性高血壓誘發(fā)的終末期腎臟病的發(fā)生。

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