康永安，胡燕榮，高 莉，楊 海，李南方

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓中心 新疆高血壓研究所，烏魯木齊 830001

GIRK4是G-蛋白偶聯(lián)的內(nèi)向整流型鉀離子通道(G-protein gated inward rectifier K+channel，GIRK)家族成員之一，由KCNJ5基因編碼，GIRK基因異常表達和許多臨床疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］，其作為GIRK家族成員在機體內(nèi)的病理生理作用日益受到人們的重視。目前研究已初步表明，GIRK4基因異常表達可能與心房纖顫［2］、肥胖及代謝綜合征［3］等疾病相關(guān)。最近Choi等［4］研究表明，GIRK4基因遺傳變異可能與腎上腺腺瘤異常增生分泌過多醛固酮引起繼發(fā)性高血壓相關(guān)。GIRK4基因可能為代謝性疾病及循環(huán)系統(tǒng)疾病的候選基因之一，而腎臟在機體內(nèi)具有重要的內(nèi)分泌及代謝功能，并參與腎素及促紅細胞生成素的分泌，在調(diào)節(jié)水鹽代謝平衡及胰島素代謝中具有重要的作用，因而在血壓調(diào)節(jié)及物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用。本研究觀察了GIRK4基因在正常與肥胖大鼠腎臟組織中表達差異，以期為研究腎臟GIRK4表達對機體物質(zhì)與能量代謝及血壓水平等方面的影響提供理論依據(jù)。

材料和方法

實驗動物與飼料 選取同種系4周齡體形相近的健康SD大鼠30只，隨機分為實驗組和對照組，其中實驗組20只，對照組10只，均雌雄各半。SD大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，由固定培訓(xùn)合格人員進行飼養(yǎng)及管理。高脂高糖飲食配方:基礎(chǔ)飼料60%，蛋黃粉5%，豬油10%，花生5%，大豆粉5%，白糖5%，全脂奶粉8%，食鹽2%。

主要試劑 RIPA試劑盒、BCA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，GIRK4一抗 (兔抗大鼠單克隆抗體)、內(nèi)參 (小鼠抗GADPH單克隆抗體)、GIRK4二抗 (辣根酶標記山羊抗兔IgG)、甘油醛-3磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)抗體 (辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒為 Pierce公司產(chǎn)品，顯影液、定影液為天津化工產(chǎn)品，彩虹預(yù)染的蛋白Marker(相對分子質(zhì)量為12000～80000)為proteinrulerTMTransGen Biotech產(chǎn)品，葡萄糖試劑盒、三酰甘油試劑盒、膽固醇試劑盒購自上?？迫A生物工程股份有限公司。

主要儀器設(shè)備 －80℃超低溫冰箱 (三洋，日本)，超純水儀 (EASYPUE，美國)，加樣器 (Distriman，吉爾森公司)，垂直電泳儀 (Bio RAD，美國)，低溫高速離心機 (BIOFUGEPLCO，德國賀力士)，半干式轉(zhuǎn)移電泳儀 (大連競邁生物科技有限公司)，凝膠成像分析儀 (Bio RAD，美國)。

動物模型建立 實驗組大鼠給予高脂高糖飲食，構(gòu)建飲食誘導(dǎo)性肥胖大鼠模型;對照組大鼠給予普通基礎(chǔ)飼料正常喂養(yǎng)。飼養(yǎng)期間每周測量體長及體重。喂養(yǎng)至第9周 (8周+2 d)完成模型構(gòu)建，實驗組大鼠體重超過對照組體重均數(shù)的25%入選為肥胖組，對照組健存大鼠視為正常組進行后續(xù)實驗。禁食12 h后，處死肥胖組和正常組入選大鼠，留取血樣行生化指標檢測并留取腎臟等組織器官以液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

生化指標檢測及脂肪系數(shù)計算 處死實驗組和對照組入選大鼠，留取血樣后及時應(yīng)用生化試劑盒檢測血清葡萄糖、三酰甘油、總膽固醇;分離大鼠生殖器旁脂肪，稱量脂肪濕重，用脂肪濕重除以大鼠體重計作脂肪系數(shù)。

正常與肥胖大鼠腎臟組織細胞質(zhì)總蛋白的提取從液氮中取冷凍腎臟組織標本200 mg放入備用EP管中，置于冰上剪碎，加入1 ml 4℃預(yù)冷的PBS，然后在低溫離心機4℃ 3000 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS重復(fù)洗滌兩次，棄上清液在沉淀中加入0.4 ml RIPA裂解液 (加入PMSF 10 μl+蛋白酶抑制劑5 μl)，然后置于冰上超聲破碎 (5 s work+20 s rest，2 cycles)，最后在低溫離心機上以4℃ 15000 r/min離心15 min，所得上清液即為細胞質(zhì)蛋白提取液，放置－80℃?zhèn)溆谩?/p>

細胞質(zhì)總蛋白濃度的檢測 參照BCA試劑盒說明按以下流程檢測各組織細胞質(zhì)總蛋白濃度:(1)根據(jù)待測樣品數(shù)量配制工作液 (A液與B液的體積比為50∶1);(2)根據(jù)樣品數(shù)量配制標準蛋白量(把5%BSA用PBS稀釋到10倍);(3)把稀釋好的標準蛋白按照 0、1、2、4、8、12、16、20 μl分別加入96孔板，然后用PBS把各孔溶液補到20 μl;(4)取10 μl樣品加到96孔板對應(yīng)位置，然后用PBS把各樣品孔溶液補到20 μl;(5)向各孔中加入200 μl工作液，用加樣器輕輕吹打，室溫放置2 h，然后用酶標儀測量樣品蛋白濃度為0.2～1μg。

免疫印跡 各組取等量蛋白 (5μg)上樣于SDS-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)，預(yù)留一泳道上彩虹預(yù)染的蛋白Marker，凝膠中分離膠8%，濃縮膠5%。電泳起始電壓為80 V，待染料由濃縮膠進入分離膠后電壓調(diào)至100 V，當(dāng)染料抵達分離膠底部時(約120 min)終止電泳。電泳結(jié)束后，通過半干式轉(zhuǎn)移電泳儀把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓9 V、30 min。成功轉(zhuǎn)膜后，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開并分別標記，把膜置于含5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉的封閉液 (5%脫脂奶粉、Tris-HCl pH 8.0、Tween20、NaCl)中4℃過夜封閉，用 TBST(Tris-HCl pH 8.0、Tween20、NaCl)洗膜5 s，然后把目的蛋白膜及內(nèi)參蛋白膜分別置于1%BSA稀釋的GIRK4一抗 (兔抗大鼠單抗，體積比1∶3000稀釋)溶液和1%BSA稀釋的內(nèi)參 (小鼠抗GADPH單抗，體積比1∶2000)溶液中，室溫孵育2 h。再次用TBST洗膜5×10 min，把由GIRK4一抗溶液孵育的目的蛋白膜、內(nèi)參溶液孵育的內(nèi)參蛋白膜分別放入1%BSA稀釋的GIRK4二抗 (辣根酶標記山羊抗兔IgG，體積比1∶5000)、1%BSA稀釋的GADPH抗體 (辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，體積比1∶5000)溶液中室溫孵育2 h，然后用TBST洗膜5×10 min，ECL試劑盒暗室顯影，X線膠片曝光、洗片可顯示GIRK4及GADPH蛋白質(zhì)條帶。置于凝膠成像儀中照相并應(yīng)用Quantity One軟件對GIRK4及GADPH蛋白質(zhì)條帶灰度進行定量分析處理，用GIRK4蛋白目的條帶與GADPH條帶的灰度值比值表示GIRK4蛋白的相對表達強度 (GIRK4/GADPH)。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組大鼠一般情況比較 模型構(gòu)建前，兩組大鼠在體長及體重方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P均＞0.05);模型構(gòu)建后，肥胖組大鼠體長及體重、脂肪墊濕重、脂肪系數(shù)均明顯大于正常組 (P均＜0.001)，血糖、總膽固醇、三酰甘油水平也均明顯高于正常組 (P均 ＜0.05)(表1)。

兩組大鼠腎臟組織GIRK4蛋白的表達 肥胖組大鼠腎臟組織GIRK4蛋白相對表達量為1.75±0.42，明顯低于正常組大鼠的3.37±0.68(P＜0.05)(圖1)。

討 論

圖1 GIRK4蛋白在正常組 (1、2)與肥胖組 (3、4)大鼠腎臟組織的表達Fig 1 Protein expressions of GIRK4 in rats of normal group(1，2)and obese group(3，4)

GIRK4是GIRK家族成員之一，其在哺乳動物生命活動中具有重要的病理生理意義。Schoots等［5］在1999年用Northern blot技術(shù)就已描述了GIRK4在人體胰腺、胎盤、肺、心、腦等臟器的分布，但僅表述了GIRK4基因在人體部分臟器存在表達，而目前國內(nèi)外對GIRK4在各臟器蛋白表達水平的定量研究鮮有報道，這一研究現(xiàn)狀已不能滿足指導(dǎo)科研工作者探索GIRK4基因與相關(guān)臨床疾病間關(guān)系的需求。

在各種復(fù)雜的生理和病理情況下，正常原核生物體的機體能夠根據(jù)自身需要從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后加工和蛋白質(zhì)降解等不同層次對蛋白質(zhì)的合成進行調(diào)控［6］。蛋白質(zhì)是基因表達在機體內(nèi)的最終體現(xiàn)形式，其表達量體現(xiàn)了該基因?qū)C體功能的影響程度。本研究在成功構(gòu)建飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用Western blot技術(shù)對正常與肥胖大鼠腎臟GIRK4蛋白表達進行了定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肥胖組大鼠腎臟組織GIRK4蛋白表達量明顯低于正常組。

Perry等［3］研究表明，GIRK4基因在下丘腦的表達可能與肥胖、代謝綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。在周圍組織器官中，腎臟作為機體重要的內(nèi)分泌及代謝器官，參與腎素及促紅細胞生成素的分泌，而且在調(diào)節(jié)水鹽代謝平衡及胰島素代謝中具有重要的作用。GIRK4基因在肥胖大鼠腎臟組織的低表達是否參與腎臟腎素分泌、胰島素及水鹽代謝等，進而影響機體血壓調(diào)節(jié)及血糖、血脂代謝，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。

表1 正常組與肥胖組大鼠一般情況比較Table 1 Comparison of the general data between the normal rats and obese rats

高血糖、高血壓、血脂紊亂分別與肥胖有關(guān)［7-8］，而且成人發(fā)生高血糖、高血壓、血脂紊亂聚集與肥胖存在一定關(guān)聯(lián)［9］。眾所周知，腎臟在機體內(nèi)作為代謝器官對胰島素的代謝起著重要作用，而胰島素代謝異常及胰島素抵抗與眾多臨床疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的重要發(fā)病環(huán)節(jié)之一，而且是代謝綜合征、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素［10-11］。世界衛(wèi)生組織關(guān)于代謝綜合征的診斷標準中明確將胰島素抵抗列為診斷標準之一，并強調(diào)了胰島素抵抗在代謝綜合征中的重要性。大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，高胰島素血癥和高血壓呈明顯的正相關(guān)［12-13］，高胰島素血癥可能介入了肥胖所致高血壓，是肥胖與高血壓相關(guān)聯(lián)的橋梁。楊劍等［14］研究顯示，胰島素可調(diào)節(jié)腎臟近曲小管上皮細胞多巴胺D5的表達與功能，該調(diào)節(jié)作用異常可能在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。在高血壓的形成機制中除了胰島素抵抗的可能因素外，GIRK4基因在肥胖大鼠腎臟低表達對腎素水平的影響亦可能是導(dǎo)致肥胖機體高血壓發(fā)病率較高的原因之一。Ziccardi等［15］研究表明，體重減輕后循環(huán)及脂肪組織中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性降低，是降壓的主要機制，同時還可改善內(nèi)皮功能和壓力反射，降低交感神經(jīng)活性。綜上，肥胖機體內(nèi)的一系列病理生理變化可能與肥胖機體內(nèi)腎臟組織GIRK4基因異常表達之間具有一定關(guān)聯(lián)性，但尚需要進一步研究證實。

［1］Luscher C，Slesinger PA.Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium(GIRK)channels in health and disease ［J］.Nat Rev Neurosci，2010，11(5):301-315.

［2］高翔，劉金平，王玉，等.心房顫動患者心房肌乙酰膽堿興奮鉀電流通道基因和蛋白的表達［J］.臨床心血管病雜志，2009，25(8):569-572.

［3］Perry CA，Pravetoni M，Teske JA，et al.Predisposition to late-onset obesity in GIRK4 knockout mice ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(23):8148-8153.

［4］Choi M，Scholl UI，Yue P，et al.K+channel mutations in adrenal aldosterone-producing adenomas and hereditary hypertension［J］.Science，2011，331(6018):768-772.

［5］Schoots O，Wilson JM，Ethier N，et al.Co-expression of human Kir3 subunits can yield channels with different functional properties［J］.Cell Signal，1999，11(12):871-883.

［6］Kubo Y，Baldwin TJ，Jan YN，et al.Primary structure and functional expression of a mouse inward rectifier potassium channel［J］.Nature，1993，362(6416):127-133.

［7］Decoda Study Group，Nyamdorj R，Qiao Q，et al.BMI compared with central obesity indicators in relation to diabetes and hypertension in Asians ［J］.Obesity，2008，16(7):1622-1635.

［8］趙連成，李瑩，武陽豐，等.不同體重指數(shù)和腰圍水平與血清高密度脂蛋白膽固醇的關(guān)系［J］.中華心血管病雜志，2003，31(4):302-305.

［9］任艷軍，劉慶敏，李莉，等.成人肥胖與高血糖高血壓血脂紊亂聚集的關(guān)系［J］.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，1:56-58.

［10］Reilly MP，Wolfe ML，Rhodes T，et al.Measures of insulin resistance add incremental value to the clinical diagnosis of metabolic syndrome in association with coronary atherosclerosis［J］.Circulation，2004，110(7):803-809.

［11］程維平，李南方，嚴志濤，等.睡眠呼吸暫停相關(guān)性高血壓頸動脈硬化的危險因素 ［J］.中華內(nèi)科雜志，2011，50(12):1026-1029.

［12］Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，et al.The hormone resistin links obesity to diabetes ［J］.Nature，2001，409(6818):307-312.

［13］Kashyap SR，Defronzo RA.The insulin resistance syndrome:physiological considerations ［J］.Diab Vasc Dis Res，2007，4(1):13-19.

［14］楊劍，韓愈，黃河飛，等.胰島素對腎臟近曲小管上皮細胞多巴胺D5受體表達和功能的影響［J］.中華高血壓雜志，2008，16(5):431-434.

［15］Ziccardi P，Nappo F，Giugliano G，et al.Reduction of inflammatory cytokine concentrations and improvement of endothelial functions in obese women afterweight loss over one year［J］.Circulation，2002，105(7):804-809.