劉海燕，溫志鵬，文 明，賀海容，譚書德，李少林

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016

惡性腫瘤是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病，在許多國家位列居民死因的第一或第二位，這是由于目前仍然缺乏針對腫瘤的早期特異性診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)警、療效預(yù)測及有效治療的臨床方法。分子影像學(xué)能夠在解剖形態(tài)基礎(chǔ)上更為深入地揭示組織的生物特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)早期的分子變異及病理改變過程，無創(chuàng)、可重復(fù)地提供組織定量、定時(shí)、可視化的分子及基因信息，因此可望實(shí)現(xiàn)腫瘤基因水平的特異性診斷［1-2］。在分子影像學(xué)研究中，制備特異性高、親和力好的探針，是實(shí)現(xiàn)活體成像的關(guān)鍵因素［3］。借鑒分子生物學(xué)中的反義基因技術(shù)，本課題組在成功制備超順磁性氧化鐵 (superparamagnetic iron oxide，SPIO)標(biāo)記的c-erbB-2癌基因反義寡脫氧核苷酸 (anti-senseoligodeoxynucleotides，ASODN)探針基礎(chǔ)上 (即磁性c-erbB-2反義探針)［4-5］，將該探針用于體外轉(zhuǎn)染高表達(dá)c-erbB-2癌基因的SK-Br-3腫瘤細(xì)胞株，初步發(fā)現(xiàn)其同時(shí)具有診斷與治療的功能［6］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該探針的特性，本研究通過采用不同質(zhì)量濃度探針轉(zhuǎn)染SK-Br-3細(xì)胞株，觀察其對細(xì)胞形態(tài)及表達(dá)的影響，以期尋找出最佳的探針轉(zhuǎn)染濃度。

材料和方法

主要材料及儀器 磁性c-erbB-2反義探針系本課題組制備［4-5］并獲得國家發(fā)明專利授權(quán) (專利號ZL 200710092512.5)，SK-Br-3腫瘤細(xì)胞株 (中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胰蛋白酶、胎牛血清 (美國 Hyclone公司)，亞鐵氰化鉀(上海生物工程有限公司)，核固紅 (武漢博士德公司)，CCK-8試劑盒 (凱基生物)，鼠抗人c-erbB-2抗體(Invitogen公司)，Actin抗體、辣根標(biāo)記的抗鼠二抗、細(xì)胞裂解液、PVDF膜、聚丙烯酰胺等Western blot相關(guān)試劑 (碧云天生物技術(shù)研究所)，透射電鏡 (HITACHI7500型，日立公司)，原子吸收光譜儀 (Z-5000型，日立公司)，1.5T超導(dǎo)型MR成像儀 (美國GE公司)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件 SK-Br-3腫瘤細(xì)胞株于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將反義探針用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，制成含鐵終質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100 mg/L的標(biāo)記培養(yǎng)液，室溫下標(biāo)記SK-Br-3腫瘤細(xì)胞，置于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

反義探針轉(zhuǎn)染效率檢測

普魯士藍(lán)染色:取1塊15孔板預(yù)先放有細(xì)胞爬片的24孔板，每孔加入1 ml細(xì)胞懸液 (細(xì)胞數(shù)目1×104/ml)，將培養(yǎng)板放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)液，各孔依次加入1 ml標(biāo)記培養(yǎng)液，共5個(gè)質(zhì)量濃度組，每個(gè)組做3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)板放入5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后取出。各組采用4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定40 min，PBS液洗滌5 min×3次，在2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))亞鐵氰化鉀+等量2%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸水溶液中孵育30 min，PBS液洗滌5 min×3次，核固紅復(fù)染5 min，PBS液洗滌5 min×3次，晾干，二甲苯透明處理10 min后封片，光鏡下隨機(jī)對各個(gè)樣本分別選取3個(gè)高倍視野照相。

細(xì)胞鐵含量測定:采用原子吸收光譜法。取各組細(xì)胞重懸于1 ml培養(yǎng)基中 (細(xì)胞數(shù)目為1×103/ml)，用2 ml/L的酸液 (高氯酸與硝酸按體積比3∶1混合)消化，去離子水溶解，60℃加熱3 h，棄上清液后每組取3個(gè)樣品放置于原子吸收光譜儀自動(dòng)吸管內(nèi)，在建立各種質(zhì)量濃度的鐵標(biāo)準(zhǔn)校對曲線后，測定并分析各組細(xì)胞的平均鐵含量。

透射電鏡檢測:各組細(xì)胞(2×106/ml)用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，1200 r/min離心10 min，吸凈上清液，沿管壁緩慢加入2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液，4℃固定1 h，1000 r/min離心5 min，棄固定液，1%(體積分?jǐn)?shù))鋨酸固定1 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片，透射電鏡下觀察。

細(xì)胞活性檢測

臺(tái)盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn):取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞 (1×105/ml)懸液5 μl，與5 μl 0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臺(tái)盼藍(lán)溶液混合1 min，之后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞活力 (臺(tái)盼藍(lán)拒染率)=染色陰性細(xì)胞數(shù)/100個(gè)細(xì)胞×100%，每組測定3個(gè)樣品。

CCK-8實(shí)驗(yàn):取96孔板1塊，加入細(xì)胞100 μl/孔(約1.5×103個(gè))，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加入不同質(zhì)量濃度的5組反義探針，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將96孔板在37℃、含5%CO2及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，向每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，37℃下孵育2 h后，在酶標(biāo)儀上450 nm波長處讀取每孔的光密度值 (D)。各組分別設(shè)立各自的空白對照 (完全培養(yǎng)基、無細(xì)胞)及細(xì)胞對照 (無探針轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)，計(jì)算各重復(fù)孔的D值(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，細(xì)胞存活率%= ［(加藥細(xì)胞D－空白對照D)/(對照細(xì)胞D－空白對照D)］×100%。

c-erbB-2蛋白表達(dá)檢測:分別收集各組細(xì)胞 (1×106/ml)，0.01 mol/L PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，冰上提取胞漿蛋白，用酶標(biāo)儀檢測蛋白質(zhì)濃度，100℃煮樣10 min，SDS-PAGE凝膠電泳，用6%濃縮膠、10%分離膠100 V、30 min，再130 V、90 min，然后350 mA、150 min恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，以Actin蛋白作為內(nèi)參蛋白，將膜移至含有5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉液中室溫?fù)u動(dòng)4 h，1×TBST洗滌，加抗人c-erbB-2蛋白抗體 (體積比1∶200)、Actin(體積比1∶1000)抗體，4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(體積比 1∶5000、1∶1500)，37℃ 孵育 1 h，1 × TBST洗滌3次，5 min/次，用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光劑ECL顯影、定影、晾干后掃描，圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶。

細(xì)胞MR成像:設(shè)未加探針的SK-Br-3細(xì)胞組為對照組，將各組細(xì)胞 (5×105/ml)分別包埋于0.5 ml 0.3%瓊脂糖的EP管中，冷卻凝膠形成后，固定EP管，采用1.5T超導(dǎo)型MR成像儀 (美國GE公司)橫斷位掃描。掃描參數(shù)為:GRE T2*WI序列，腕關(guān)節(jié)線圈，翻轉(zhuǎn)角30°，TR/TE 225/5.3 ms，視野16.0 mm，層厚1.8 cm，矩陣256×128。T2*值為畫定每個(gè)試管圖像中央T2*值3次的平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，細(xì)胞內(nèi)平均鐵含量、細(xì)胞存活率及T2*值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

普魯士藍(lán)染色結(jié)果:隨著磁性c-erbB-2反義探針質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色顆粒相應(yīng)增加，當(dāng)反義探針質(zhì)量濃度增加到25 mg/L時(shí)，細(xì)胞藍(lán)染率達(dá)100%，而50、100 mg/L組可見較多藍(lán)染鐵顆粒黏附于細(xì)胞表面甚至游離于細(xì)胞外 (圖1)。

細(xì)胞鐵含量:SK-Br-3細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)規(guī)定的范圍內(nèi)，按濃度依賴式攝取反義探針。5、10、25、50、100mg/L組的細(xì)胞內(nèi)平均鐵含量分別為 (8.82±0.41)、(11.02±0.31)、(18.38±0.28)、(20.27±0.34)、(21.15±0.29)pg，其中，25mg/L組與5和10 mg/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.05);與50和100 mg/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05)。

透射電鏡觀察結(jié)果:各組均可見斑片狀或點(diǎn)狀分布的高密度氧化鐵顆粒 (圖2A)，隨著磁性c-erbB-2反義探針質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)氧化鐵顆粒相應(yīng)增加。在25、50、100 mg/L組，還可以觀察到胞膜出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞固縮、核固縮以及向外突出的凋亡小體 (圖2B)。

圖1 普魯士藍(lán)染色結(jié)果 (×200)Fig 1 Results of Prussian blue staining(×200)

圖2 探針鐵質(zhì)量濃度25 mg/L組電鏡觀察結(jié)果Fig 2 Electron microscopy of the 25 mg/L group

細(xì)胞活性檢測結(jié)果

臺(tái)盼藍(lán)拒染率:5、10、25、50、100 mg/L組臺(tái)盼藍(lán)拒染率分別為 (98.99±1.67)%、(97.82±1.21)%、(80.13±1.24)%、(77.25±1.43)%、(71.32±1.54)%，其中，25 mg/L組與5和10 mg/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.05);與50和100 mg/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05)。

細(xì)胞存活率:5、10、25、50、100 mg/L組細(xì)胞存活率分別為95.88%、91.39%、79.94%、71.81%、69.53%，其中，25 mg/L以下各質(zhì)量濃度組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);≥25 mg/L的各組細(xì)胞存活率顯著下降 (P＜0.05)，但50和100 mg/L組與25 mg/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。

c-erbB-2蛋白表達(dá)變化:質(zhì)量濃度≥25 mg/L組對SK-Br-3細(xì)胞c-erbB-2蛋白的表達(dá)抑制率明顯高于低質(zhì)量濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，但50和100 mg/L組表達(dá)抑制率與25 mg/L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，圖3)。

圖3 Western blot條帶圖Fig 3 Western blot band diagram

磁共振成像結(jié)果:磁共振掃描下T2*WI信號隨反義探針質(zhì)量濃度的增加而降低，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，T2*值明顯降低，為134.728±0.647，對照組為306.263±0.878，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而質(zhì)量濃度為50、100 mg/L時(shí)，T2*WI信號降低程度與25 mg/L組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖4)。

討 論

本課題組制備的磁性c-erbB-2反義探針結(jié)構(gòu)主要包括信號組件和親和組件兩個(gè)部分，信號組件為SPIO，親和組件是針對c-erbB-2癌基因的ASODN。按照設(shè)計(jì)理念，根據(jù)反義基因理論［7］，將c-erbB-2癌基因mRNA的特異序列作為研究的靶點(diǎn)，制備與其序列互補(bǔ)的ASODN片段，在引入細(xì)胞后，就能夠按堿基互補(bǔ)原則與該癌基因的mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合，封閉它們的轉(zhuǎn)錄、翻譯，沉默基因表達(dá)，起到治療腫瘤的目的。此外，探針中的SPIO能增加SK-Br-3細(xì)胞內(nèi)的鐵濃度，被MR掃描所檢測，能達(dá)到特異性診斷的目的。本課題組的前期研究表明，探針在特定濃度 (鐵質(zhì)量濃度25 mg/L)及特定時(shí)間 (轉(zhuǎn)染24 h)下，能順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，具有對SK-Br-3腫瘤細(xì)胞診斷及治療的雙功能［5-6］。

圖4 各質(zhì)量濃度組磁共振結(jié)果Fig 4 MRI findings in each concentration group

在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過用不同質(zhì)量濃度的磁性c-erbB-2反義探針進(jìn)一步探索其轉(zhuǎn)染SKBr-3腫瘤細(xì)胞的最佳濃度與變化規(guī)律，選擇的觀察指標(biāo)結(jié)合形態(tài)與功能同步進(jìn)行。普魯士藍(lán)染色及細(xì)胞鐵含量結(jié)果均顯示:SK-Br-3細(xì)胞在一定范圍內(nèi)按質(zhì)量濃度大小呈依賴式攝取探針，當(dāng)探針的鐵質(zhì)量濃度大于25 mg/L時(shí)，細(xì)胞攝取達(dá)到飽和，這與蔡金華等［8］、Yu等［9］的研究結(jié)果一致;隨著反義探針質(zhì)量濃度的增大，SK-Br-3細(xì)胞內(nèi)的ASODN增多，細(xì)胞活性下降，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，細(xì)胞活力及存活率顯著降低，并出現(xiàn)凋亡小體。同時(shí)Western blot檢測結(jié)果也顯示，25 mg/L組c-erbB-2蛋白表達(dá)量明顯低于5、10 mg/L組，當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到50 mg/L或100 mg/L時(shí)，c-erbB-2蛋白表達(dá)量與25 mg/L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞活性檢測(臺(tái)盼藍(lán)拒染率及CCK-8實(shí)驗(yàn))也有同樣的發(fā)現(xiàn)。磁共振掃描下T2*值隨反義探針質(zhì)量濃度的增加而降低，當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，T2*值明顯降低，先前的文獻(xiàn)也有類似報(bào)道［10］。本研究結(jié)果表明:(1)25 mg/L是磁性c-erbB-2反義探針轉(zhuǎn)染SK-Br-3細(xì)胞的有效質(zhì)量濃度，轉(zhuǎn)染率達(dá)100%;(2)25 mg/L是磁性c-erbB-2反義探針中的ASODN進(jìn)入細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度，對細(xì)胞的生長、c-erbB-2癌蛋白的表達(dá)產(chǎn)生了明顯的、特異性的抑制作用;(3)在磁共振掃描T2*序列，25 mg/L組呈明顯低信號，可有效并特異性地顯示SK-Br-3腫瘤細(xì)胞。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)SPIO質(zhì)量濃度不大于25 mg/L時(shí)，對正常細(xì)胞生長沒有影響，而超過25 mg/L時(shí)，則會(huì)有一定程度的抑制作用［11-12］。本研究中ASODN是針對特定的靶mRNA序列設(shè)計(jì)，具有極高的特異性，由此推斷，當(dāng)反義探針的質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，對細(xì)胞表達(dá)影響是反義效應(yīng)所致。

綜上，磁性c-erbB-2反義探針質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，可以有效轉(zhuǎn)染并特異地診斷及治療乳腺癌SKBr-3細(xì)胞。不同孵育時(shí)間對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞活力的影響將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證，這將有望為進(jìn)一步活體腫瘤磁共振成像研究提供詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持。

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