蘇 鵬，劉洪峰，石磊芝

(1遼陽市中心醫(yī)院，遼寧遼陽111000;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院;3山東省臨沂市人民醫(yī)院)

食管癌的傳統(tǒng)治療手段較多，但患者的5年生存率并未明顯提高，其主要原因是腫瘤的化療耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移。研究表明，腫瘤組織內(nèi)有少數(shù)細胞具有干細胞特性，能促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生［1］。Nanog蛋白是多能干細胞的重要生物學(xué)標(biāo)志物之一，其在腫瘤組織中的高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等生物學(xué)行為密切相關(guān)［2］。目前，關(guān)于Nanog蛋白在食管癌組織中的表達及臨床意義的研究尚少，我們對此進行了研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2008年1月～2011年12月在我們3家醫(yī)院行手術(shù)切除的食管癌患者87例，男52例、女35例，年齡45～82(66±7．6)歲。按WHO組織學(xué)分型分級標(biāo)準(zhǔn)，高分化22例，中分化34例，低分化31例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例。TNM分期Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ期49例?；颊呔鶠槌醢l(fā)，術(shù)前未行放、化療。

1．2 方法

1．2．1 標(biāo)本采集 取87例患者的食管癌組織(觀察組)和距癌組織邊緣＞5 cm的癌旁組織(對照組)標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。食管癌細胞系TE-1、Eca-109購自上海中科院細胞庫。

1．2．2 食管癌組織中的Nanog蛋白檢測 應(yīng)用免疫組化PV二步法，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知的Nanog陽性蛋白染色精原細胞瘤作陽性對照。常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸抗原微波修復(fù)后自然冷卻;依次滴加一抗(1∶400稀釋)和二抗(1∶100稀釋)孵育。DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。在高倍鏡下取4個不同視野各計數(shù)200個癌細胞，按陽性細胞所占百分率分為:陰性:無陽性細胞;弱陽性:陽性細胞＜30%，呈淺黃色;中度陽性:陽性細胞30% ～50%，呈棕黃色;強陽性:陽性細胞＞50%，呈棕褐色。

1．2．3 食管癌細胞系 TE-1、Eca-109中的Nanog蛋白檢測 采用免疫熒光技術(shù)。食管癌細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，細胞于5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%融合時進行傳代。胰酶消化后吹打均勻，接種于24孔板上，5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜，4%多聚甲醛固定，Triton X-100作用15 min，5%BSA室溫封閉1 h，一抗?jié)窈?℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育2 h，Herst室溫避光復(fù)染15 min。除用5%BSA封閉后不用PBS清洗以外，其余步驟都用PBS洗3次，每次3 min;熒光照相，在200倍鏡下觀察，隨機取10～20個視野，計數(shù)500個細胞中核表達陽性染色細胞數(shù)，計算核表達陽性細胞率。

1．2．4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS16．0統(tǒng)計軟件，Nanog蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系用χ2檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 食管癌組織中的Nanog蛋白表達 對照組Nanog蛋白呈低水平表達，陽性反應(yīng)見于細胞質(zhì)內(nèi)。觀察組Nanog蛋白主要定位于細胞質(zhì)，為棕黃色顆粒，且隨組織惡性程度增高而陽性率升高，在細胞核中的表達逐漸增多，特別是在低分化細胞核中的表達明顯增多，其Nanog蛋白陽性表達率為44．83%(39/87)，對照組僅為 12．64%(11/87)，兩組比較P ＜0．05。

2．2 食管癌組織中的Nanog蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 食管癌組織Nanog蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系［例(%)］

2．3 食管癌細胞系中的Nanog蛋白表達 Nanog蛋白在食管癌細胞系Eca109、TE-1中高表達，且表達存在異質(zhì)性;多數(shù)細胞以細胞質(zhì)表達為主，少數(shù)細胞以細胞核表達為主，細胞核表達陽性率為10%。

3 討論

Nanog最初是在胚胎干細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種參與干細胞分化等功能的轉(zhuǎn)錄因子，近年來，其作為維持干細胞增殖和亞全能性的關(guān)鍵性基因及干細胞的標(biāo)記物，引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，Nanog蛋白在生殖細胞腫瘤(如睪丸原位癌、精原細胞瘤和胚胎性癌)細胞株NCCIT等，以及體細胞腫瘤(如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等)［3～7］均呈過表達，且影響這些腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療及預(yù)后。Nanog蛋白過表達可能是導(dǎo)致腫瘤組織產(chǎn)生耐藥性的原因［8］。

本研究采用免疫組化技術(shù)檢測Nanog蛋白在食管癌組織和癌旁組織中的表達，結(jié)果顯示，Nanog蛋白在癌旁正常組織中微量表達，主要在食管黏膜基底層細胞的細胞質(zhì)表達。這可能是由于基底層細胞具有干細胞性質(zhì)，是復(fù)層鱗狀上皮的增生層，而Nanog具有控制細胞增殖的功能。在食管癌組織中Nanog蛋白呈高表達，且其陽性率隨病理分期和淋巴轉(zhuǎn)移增加而升高，隨腫瘤分化程度降低而升高;與年齡、性別和腫瘤大小等臨床特征無顯著相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，Nanog能通過抑制分化基因gata4和gata6的轉(zhuǎn)錄維持細胞的低/未分化狀態(tài)［9］;本研究結(jié)果與其一致，這可能是食管癌分化程度的分子機制之一。本研究還顯示，大部分細胞Nanog蛋白表達主要在細胞質(zhì)，部分核、質(zhì)都表達，僅少量細胞有核表達，且在低分化細胞核中表達明顯增加，與以往研究結(jié)果不一致［4，10］。David 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Nanog基因中的136YKQVKT141使Nanog蛋白定位在細胞核，而Nanog中富含色氨酸的W區(qū)控制著其出核轉(zhuǎn)運。因此我們推測，Nanog蛋白表達變化是控制細胞分化的因素之一，干細胞Nanog蛋白定位于細胞核，隨著細胞分化，Nanog蛋白從細胞核中轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)執(zhí)行功能，隨著分化程度升高，Nanog蛋白隨之在細胞中消失。所以，核表達的細胞可能分化程度更低，可能就是癌組織中的腫瘤干細胞，在低分化的食管癌鱗狀細胞癌中這種細胞數(shù)多，可以解釋在細胞分子水平上低分化食管癌轉(zhuǎn)移早、進展快、預(yù)后差等臨床現(xiàn)象，因為低分化食管癌中可能含有更多的腫瘤干細胞。

本研究采用細胞免疫熒光技術(shù)檢測到Nanog蛋白在食管癌細胞系Eca109和TE-1中均呈高表達，以細胞質(zhì)表達為主，少量以細胞核表達為主，細胞核表達陽性率為10%。核表達陽性細胞較圓、較小，其特點與干細胞相似。Li等［12］認為，Nanog蛋白在腫瘤干細胞中表達，也在普通腫瘤細胞中表達，但Nanog蛋白表達與腫瘤干細胞的關(guān)系尚無定論。我們結(jié)合Nanog蛋白在食管癌組織中核表達的特點，推測食管癌的腫瘤干細胞包含以核表達為主的少部分細胞。

綜上所述，Nanog蛋白在食管癌組織中呈高表達，且與食管癌的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度密切相關(guān)，這也是食管癌中存在腫瘤樣干細胞的間接證明。Nanog蛋白可在食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用，成為食管癌惡性程度的評價指標(biāo)，或作為誘導(dǎo)食管癌分化成熟的理想靶點之一，為食管癌化療耐藥的研究提供新的思路。

［1］Jordan CT，Guzman ML，Noble M．Cancer stem cells［J］．N Engl J Med，2006，355(12):1253-1261．

［2］Dalerba P，Cho RW，Clarke MF．Cancer stem cells:Models and concepts［J］．Annu Rev Med，2007，58(9):267-284．

［3］Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al．A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into scid mice［J］．Nature，1994，367(6464):645-648．

［4］Siu MK，Wong ES，Kong DS，et al．Stem cell transcription factor nanog controls cell migration and invasion via dysregulation of ecadherin and foxj1 and contributes to adverse clinical outcome in ovarian cancers［J］．Oncogene，2012，363(9):1038-1048．

［5］Seigel GM，Hackam AS，Ganguly A，et al．Human embryonic and neuronal stem cell markers in retinoblastoma［J］．Mol Vis，2007，13(6):823-832．

［6］Gu TT，Liu SY，Zheng PS．Cytoplasmic nanog-positive stromal cells promote human cervical cancer progression［J］．Am JPathol，2012，181(2):652-661．

［7］ Freberg CT，Dahl JA，Timoskainen S，et al．Epigenetic reprogramming of oct4 and nanog regulatory regions by embryonal carcinoma cell extract［J］．Mol Biol Cell，2007，18(5):1543-1553．

［8］Fujii H，Honoki K，Tsujiuchi T，et al．Sphere-forming stem-like cell populations with drug resistance in human sarcoma cell lines［J］．Int J Oncol，2009，34(5):1381-1386．

［9］Pan G，Thomson JA．Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency［J］．Cell Res，2007，17(1):42-49．

［10］Ye F，Zhou C，Cheng Q，Shen J，et al．Stem-cell-abundant proteins nanog，nucleostemin and musashi1 are highly expressed in malignant cervical epithelial cells［J］．BMC Cancer，2008，8(4):1-5．

［11］Chang DF，Tsai SC，Wang XC，et al．Molecular characterization of the human nanog protein［J］．Stem Cells，2009，27(4):812-821．

［12］Li H，Gao Q，Guo L，et al．The pten/pi3k/akt pathway regulates stem-like cells in primary esophageal carcinoma cells［J］．Cancer Biol Ther，2011，11(11):950-958．