曹 毅 徐雷鳴 潘 勤 王曉穎 沈 峰 陳光榆 范建高

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver，NSFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌。近來有研究報(bào)道認(rèn)為腸道菌群與肥胖和胰島素敏感性相關(guān)，因考慮到NASH與胰島素抵抗（IR）和肥胖等之間的聯(lián)系，推測調(diào)節(jié)腸道菌群可能對NASH的發(fā)生發(fā)展存在一定的影響。由于黃連素通過腸道吸收量有限[1，2]，故我們選用這一在臨床中常用治療腹瀉的中成藥來調(diào)節(jié)腸道菌群，以觀察其對NASH動物的治療作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、動物及模型制備 7~8周齡清潔級雄性Babl/c小鼠35只，體重18~22g，購于上海斯萊克公司。在SPF級動物房，將小鼠隨機(jī)分7籠飼養(yǎng)，每籠5只。室溫保持在22±2℃，相對濕度65%，按正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)光照時間。在觀察期內(nèi)，動物自由飲水及進(jìn)食。在普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，將動物隨機(jī)分為對照組（n=10）、模型組（n=10）和干預(yù)組（n=15）。對照組動物予以普通飼料，模型組和干預(yù)組持續(xù)給予高脂飼料（10%豬油+2%膽固醇+88%基礎(chǔ)飼料）。高脂飼料熱量構(gòu)成比為:52%碳水化合物，30%脂肪，18%蛋白質(zhì)，總熱卡為4.8 kcal/g。普通飼料熱量構(gòu)成比為：67%碳水化合物，10%脂肪，23%蛋白質(zhì)，總熱卡為3.6 kcal/g[3]。自高脂飲食第5周開始，給予給藥組小鼠黃連素（美國Sigma公司，溶于蒸餾水中）200mg.kg-1.d-1灌胃；對照組和模型組每日給予等量蒸餾水，持續(xù)灌胃9周。高脂飲食喂養(yǎng)共13周后，動物隔夜禁食，次日經(jīng)眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死小鼠。血液經(jīng)3000rpm離心15分鐘，取血清凍存于-80℃冰箱。剖腹，取肝臟和盲腸內(nèi)容物。部分肝臟用中性甲醛固定，制備石蠟切片，常規(guī)HE染色。其余組織置-80℃冰箱保存。

二、血生化指標(biāo)的測定 使用生化分析儀測定各項(xiàng)生化指標(biāo)。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），即空腹血漿胰島素（μU/ml）×空腹血糖（mmol/L）/22.5。

三、肝組織病理學(xué)觀察 采用NAS積分進(jìn)行NAFLD活動度評分（0~8分）：肝細(xì)胞脂肪變性程度為0～3分，肝小葉炎癥為0～3分，肝細(xì)胞氣球樣變?yōu)?～2分?？偡帧?分為NASH。評分方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行[4]。

四、肝組織炎性因子mRNA水平檢測 稱量約50mg肝組織，使用Trizol試劑（日本TAKARA公司）提取肝組織總RNA，采用RT-PCR法轉(zhuǎn)錄成cDNA。按 50ng/μl的濃度經(jīng)過熒光定量 PCR擴(kuò)增，以RPL19為內(nèi)參照，采用熒光定量PCR法檢測CD14、TNF-α、IL-1和IL-6mRNA的相對表達(dá)水平。引物序列選自參考文獻(xiàn)[5，6]，由上海生工公司合成。

五、腸道菌群數(shù)量的檢測 稱量150～200mg盲腸內(nèi)容物，使用糞便DNA抽提試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA。稀釋至30ng/μl后，以通用細(xì)菌為內(nèi)參照，采用熒光定量PCR法相對定量乳酸菌和雙歧桿菌核酸。引物序列選自參考文獻(xiàn)[7，8]，由上海生工公司合成。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，所有數(shù)據(jù)均用±s 表示，采用單因素方差分析，然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、小鼠一般情況及NAS積分 在實(shí)驗(yàn)過程中因灌胃導(dǎo)致動物死亡5只，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，對照組存活小鼠9只，模型組10只，干預(yù)組11只。與對照組比，模型組動物體重增加（P<0.05），睪脂指數(shù)顯著上升（P<0.01），NAS積分明顯高于對照組（P<0.01）；與模型組比，干預(yù)組動物體重下降（P<0.05），睪脂指數(shù)呈下降趨勢，NAS積分明顯減少（P<0.01）。而在飲食方面，三組攝入熱卡量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮體重的變化與熱量攝入量無關(guān)。根據(jù)NAFLD活動度評分判斷，模型組有6只小鼠NASH模型造模成功，即從該6只小鼠采集樣本檢測以下指標(biāo)，對照組及干預(yù)組各隨機(jī)抽取6只小鼠進(jìn)行檢測，見表1。

二、肝功能和糖代謝情況 與對照組比，模型組AST和胰島素升高（P 均<0.05），ALT、空腹血糖及HOMA-IR顯著上升（P 均<0.01）；與模型組比，干預(yù)組空腹血糖及胰島素水平降低（P 均<0.05），ALT和HOMA-IR明顯下降（P 均 <0.01），見表2。

表1 各組小鼠有關(guān)指標(biāo)和NAS積分（±s）的比較

表1 各組小鼠有關(guān)指標(biāo)和NAS積分（±s）的比較

與對照組比，①P<0.05，②P<0.01；與模型組比，③P<0.05，④P<0.01

只數(shù) 熱量（kcal/d）體重（g）睪脂指數(shù) NAS積分對照組 9 18.57±2.90 28.67±1.58 1.02±0.12 0.44±0.53模型組 10 18.70±2.48 30.70±1.83① 1.49±0.37② 4.60±1.07②干預(yù)組 11 18.33±4.89 28.64±2.25③ 1.28±0.34 2.73±0.90②④

三、肝組織炎癥因子mRNA水平變化 與對照組比，模型組CD14mRNA水平呈升高趨勢，IL-6、IL-1和TNF-α mRNA水平均顯著升高（P 均<0.01）；與模型組比，干預(yù)組 CD14、IL-6、IL-1和 TNF-α mRNA水平明顯降低（P 均 <0.01），見表3。

表2 小鼠血清生化指標(biāo)（±s）的比較

表2 小鼠血清生化指標(biāo)（±s）的比較

與對照組比，①P<0.05，②P<0.01；與模型組比，③P<0.05，④P<0.01

只數(shù) ALT（U/L）AST（U/L）FBG（mmol/L）胰島素（pmol/L）HOMA-IR對照組 6 120.00±10.22 65.00±3.63 4.69±0.75 0.45±0.36 13.47±11.18模型組 6 346.00±142.01② 137.50±88.50① 7.56±1.38② 1.67±0.95① 76.67±38.12②干預(yù)組 6 175.00±20.14④ 88.50±11.18 6.13±0.89①③ 0.46±0.33③ 18.34±12.45④

表3 各組小鼠肝組織炎癥因子mRNA水平（±s）的比較

表3 各組小鼠肝組織炎癥因子mRNA水平（±s）的比較

與對照組比，①P<0.05，②P<0.01；與模型組比，③P<0.05，④P<0.01

只數(shù) CD14 IL-1 IL-6 NAS積分對照組 6 0.261±0.032 0.421±0.083 0.258±0.084 1.336±0.156模型組 6 0.321±0.106 1.539±0.437② 0.580±0.083② 4.482±0.820②干預(yù)組 6 0.045±0.006②④ 0.243±0.067④ 0.249±0.046④ 0.553±0.553①④

四、肝組織學(xué)改變 在光鏡下，對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞在中央靜脈周圍呈放射狀排列，肝細(xì)胞內(nèi)未見脂滴（圖1A）；模型組肝細(xì)胞脂肪變，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡，大小不一，細(xì)胞間有炎性細(xì)胞浸潤，可見炎癥壞死灶融合成片（圖1B）；干預(yù)組肝細(xì)胞脂肪變減輕，少見炎性細(xì)胞浸潤，仍有氣球樣變（圖1C）。

圖1 各組小鼠肝組織學(xué)表現(xiàn) （HE，200×）

五、盲腸內(nèi)容物乳酸菌和雙歧桿菌變化 與對照組比，模型組盲腸內(nèi)容物中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯下降（P 均<0.05）；與模型組比，干預(yù)組乳酸菌呈回升趨勢，雙歧桿菌則明顯升高（P<0.01），見表4。

表4 小鼠盲腸內(nèi)容物中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量（±s）的比較

表4 小鼠盲腸內(nèi)容物中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量（±s）的比較

與對照組比，①P<0.05，②P<0.01；與模型組比較，③P<0.05，④P<0.01

只數(shù) 乳酸菌 雙歧桿菌對照組 6 94.682±64.089 1.334±0.709模型組 6 0.010±0.006① 0.495±0.082①干預(yù)組 6 13.615±16.394 2.160±0.629①④

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組糞便中乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌數(shù)量顯著低于對照組，而口服黃連素的干預(yù)組動物乳酸菌數(shù)量呈上升趨勢，其雙歧桿菌數(shù)甚至超過對照組。雙歧桿菌和乳酸菌是人體腸道正常菌群中的優(yōu)勢菌種，與其他厭氧菌一起共同形成一個生物學(xué)屏障，構(gòu)成腸道的定植抗力，阻止致病菌、條件致病菌的定制和入侵，減少腸源性內(nèi)毒素的來源，降低血中內(nèi)毒素水平。Cani等[9]發(fā)現(xiàn)由于雙歧桿菌與緊密連接mRNA水平和蛋白表達(dá)有一定的聯(lián)系，腸菌中雙歧桿菌數(shù)量上升對改善體內(nèi)腸通透性的效果明顯。 乳酸菌可以抵制大腸桿菌引起的緊密連接蛋白重新分布，保護(hù)腸上皮的屏障功能[10，11]。高脂飲食飼養(yǎng)小鼠的腸菌中雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量相對正常組下降，予抗生素后兩菌回升的同時，伴隨著代謝性內(nèi)毒素血癥的減輕[5]。

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的一種脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）與微量蛋白質(zhì)的復(fù)合物。LPS是內(nèi)毒素活性成分，腸源性LPS結(jié)合脂多糖綁定蛋白，通過膜表面受體CD14，激活庫普弗細(xì)胞并活化核因子，引起腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（interleukin，IL-1）、IL-6等促炎性因子活化。CD14是庫普弗細(xì)胞膜表面的LPS受體，給CD14沉默小鼠注射LPS則不出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變和炎癥[12]；TNF-α 由激活的庫普弗細(xì)胞分泌，是參與NASH發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)，高脂喂養(yǎng)的ob/ob小鼠若同時予以抗-TNF-α 抗體，4周后可發(fā)現(xiàn)肝組織學(xué)改善，伴肝炎指標(biāo)下降、IR減輕以及肝臟脂肪酸減少[13]；IL-1介導(dǎo)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)肝內(nèi)甘油三酯儲存及肝內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)[14]；IL-6激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化，以旁分泌、自分泌方式作用于組織細(xì)胞，肝炎患者體內(nèi)IL-6活性與肝細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M肝臟CD14、TNF-α、IL-1、IL-6mRNA水平升高，而給藥后肝組織炎癥性因子則明顯降低，提示黃連素作用于腸道內(nèi)容物后腸源性內(nèi)毒素減少，這可能與干預(yù)組肝組織學(xué)炎癥減輕以及肝酶下降密切相關(guān)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過13周高脂飲食喂養(yǎng)后，模型組小鼠體重明顯高于對照組，口服黃連素的干預(yù)組體重減輕接近對照組。國外也有研究表明，腸道菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)改變與肥胖的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。Backhed等[16]研究顯示腸道菌群可調(diào)節(jié)宿主能量儲備，無菌小鼠經(jīng)移植普通小鼠的腸菌后，在不改變飼料攝取和能量消耗的條件下體重明顯增加。Kalliomaki等[17]對嬰幼兒的研究隨訪發(fā)現(xiàn)，超重/肥胖組相比正常組出生嬰兒，腸道雙歧桿菌減少，提示腸道菌群異常的出現(xiàn)早于肥胖的發(fā)生。

IR是NASH發(fā)病的主要影響因素之一。它們不僅參與肝細(xì)胞脂肪變的發(fā)生，而且促進(jìn)肝細(xì)胞損傷和炎癥發(fā)展[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組空腹血糖、胰島素及HOMA-IR均明顯高于對照組和干預(yù)組，而干預(yù)組空腹血糖、胰島素和HOMA-IR與對照組相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？紤]腸道菌群經(jīng)黃連素調(diào)整后IR得以改善。近來國外研究同樣發(fā)現(xiàn)，腸源性內(nèi)毒素血癥參與IR的發(fā)病，高脂飲食飼養(yǎng)小鼠出現(xiàn)代謝性內(nèi)毒素血癥，促使體重增加和IR[18]。無菌小鼠相對普通小鼠糖耐量提高，胰島素水平降低，并可抵抗高脂飲食導(dǎo)致的IR[19]。將普通小鼠的菌群植入無菌小鼠腸道后，在飲食不變情況下無菌小鼠可出現(xiàn)明顯的IR[16]。通過抗生素調(diào)整高脂飲食飼養(yǎng)小鼠的腸道菌群，結(jié)果代謝性內(nèi)毒素血癥得以緩解，表現(xiàn)為糖耐量改善和體重減輕[5]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過利用黃連素調(diào)控腸道菌群，對高脂飲食所致的肝小葉炎癥及其主要誘發(fā)因素皆有一定的改善作用。因此，我們推測，對腸道菌群更深入研究，不僅可以更全面地闡明NASH發(fā)病機(jī)制，而且可能成為預(yù)防及治療NASH的新方向。

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