李安雪，汪立平，趙 勇

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻寡糖具有促進(jìn)雙歧桿菌的增殖、整腸、解毒、降血糖血脂、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用［1-5］。褐藻膠的酶解法，反應(yīng)條件易控制，底物特異性高，在寡糖制備各方面明顯優(yōu)于化學(xué)和物理降解，褐藻膠裂解酶已成為目前研究的熱點(diǎn)。大部分含有褐藻膠裂解酶基因的野生菌株生長(zhǎng)條件特殊，產(chǎn)酶量低，分離困難。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已構(gòu)建了表達(dá)褐藻膠裂解酶基因的工程菌［6-13］，但是利用這些工程菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生的褐藻膠裂解酶的活性依然偏低，達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)利用的要求。高細(xì)胞密度發(fā)酵(High cell density cultivation，HCDC)是指在一定條件和培養(yǎng)體系下獲得最多的細(xì)胞量，即利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)［14］。高密度發(fā)酵技術(shù)不僅增加了發(fā)酵過(guò)程中重組大腸桿菌的生物量，得到大量的目的基因產(chǎn)物，并且目的產(chǎn)物也得到質(zhì)的提高。據(jù)LeeS Y［15］計(jì)算，理論上大腸桿菌發(fā)酵所能達(dá)到的最高菌體密度為400g(DCW/L)，迄今為止，大腸桿菌發(fā)酵菌體密度最高的兩例為:非重組E.coli W3110 達(dá) 174g(DCW/L)［16］，生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸的重組菌達(dá)175.4g(DCW/L)［17］。目前，褐藻膠裂解酶基因的工程菌高密度培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。較高活性的褐藻膠裂解酶可以制備褐藻寡糖，并具有較高的利用價(jià)值，為提高褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量和活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)源于蠟樣芽孢桿菌的褐藻膠裂解酶基因進(jìn)行了克隆，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)［18］。將該菌種采用分批補(bǔ)料方式在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳濃度、氮源濃度、補(bǔ)料培養(yǎng)基濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度的控制，通過(guò)高密度發(fā)酵提高褐藻膠裂解酶生產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含表達(dá)褐藻膠裂解酶重組質(zhì)粒的工程菌E.coli BL21 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏;氨芐青霉素、IPTG 天根生化科技有限公司;其他培養(yǎng)基成分及試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，卡那霉素(10mg/mL)600μL;搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母提取物 5，NaCl 10，葡萄糖 30，卡那霉素(10mg/mL)600μL;發(fā)酵培養(yǎng)基［19］(g/L):葡萄糖 10，酵母提取物5，蛋白胨 20，K2HPO45，KH2PO43.5，(NH4)2HPO44.0，MgSO4·7H2O 1.2，檸檬酸 1.7，微量元素液(1mL/L)，卡那霉素(10mg/mL)600μL;其中微量元素液(g/L):FeSO4·7H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.225，(NH4)6MO·4H2O 0.15，CuSO4·H2O 0.15，CaCl2·H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，Na2B4O4·H2O 0.002;補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖，蛋白胨20，酵母提取物10，MgSO4·7H2O 1.2。

立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;FMG-5L-Ⅰ發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司;細(xì)胞破碎儀 LOW SURFACE TENSION LIQUIDS ORGANIC SOLVENTS;SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;UV-2000型分光光度計(jì) 上海安亭科學(xué)儀器廠;CR21G冷凍離心機(jī) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組大腸桿菌的分批發(fā)酵 將含表達(dá)褐藻膠裂解酶重組質(zhì)粒的工程菌E.coli BL21在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，按2%接種量接種于 LB培養(yǎng)基中，150r/mim，37℃，培養(yǎng) 10h，OD600約 0.7～0.8。搖瓶培養(yǎng)后［19］的種子液按5%的接種量接種于5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基體積為3L。控制的幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)為:溶氧量控制在30%～40%，轉(zhuǎn)速400r/min;在第5h加入1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)前發(fā)酵溫度自動(dòng)控制在37℃，誘導(dǎo)后發(fā)酵溫度設(shè)定為30℃;每隔2h進(jìn)行取樣，利用分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定菌體密度OD600，用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖含量;發(fā)酵結(jié)束后收集菌體制備酶液，用紫外吸收測(cè)定酶活。

1.2.2 重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵 按照1.2.1進(jìn)行接種培養(yǎng)，培養(yǎng)至10g/L的初糖濃度低于1g/L時(shí)，在不同批次培養(yǎng)中分別流加葡萄糖濃度為60、90、120、150g/L的補(bǔ)料培養(yǎng)基，根據(jù)補(bǔ)料培養(yǎng)基的體積和發(fā)酵時(shí)間，4～10h的流加速率為 100mL/h，10～16h流加速率為200mL/h。補(bǔ)料期間仍然手動(dòng)流加30%(v/v)的氨水，流加速率根據(jù)發(fā)酵液中pH的變化而改變，保持pH穩(wěn)定，使pH保持在7.0～7.2，溶氧量控制在30%～40%，轉(zhuǎn)速400r/min;溫度設(shè)定為37℃。

1.2.3 重組大腸桿菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中IPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 在分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，選擇IPTG的誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度兩個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)IPTG誘導(dǎo)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，運(yùn)用單純形法［20］對(duì)IPTG的誘導(dǎo)條件做進(jìn)一步優(yōu)化，得到最優(yōu)誘導(dǎo)條件。

1.2.4 酶液的制備 發(fā)酵進(jìn)行24h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液在4℃、8000r/min下離心10min，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌3次，加入適量PBS緩沖液重懸(菌液濃度為40mg/mL，以濕重計(jì))。菌液在4℃下預(yù)冷并均質(zhì)后在冰水浴中經(jīng)超聲波破碎(超聲波破碎條件為菌液體積50mL，NaCl濃度為0.15mol/L，破碎強(qiáng)度50%，總工作時(shí)間5min，工作/間歇時(shí)間為4s/8s)，4℃下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，上清液即為粗酶液，粗酶液利用鎳柱親和層析純化進(jìn)行純化后得到純酶液。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體密度 取一定量的發(fā)酵液，經(jīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)瓜♂尯蟮木篛D值在0.2～0.8之間，用分光光度計(jì)在600nm處測(cè)吸光值，吸光值與稀釋倍數(shù)的乘積即為發(fā)酵液的菌體密度(OD600)。

1.3.2 細(xì)胞濃度 取10mL發(fā)酵液，離心收集菌體沉淀，于105℃烘干約3h至恒重，精確稱(chēng)重，即為細(xì)胞干重。

1.3.3 殘?zhí)菨舛?DNS法［21］。

1.3.4 酶活測(cè)定 參照Preiss［22］紫外吸收法。

1.3.5 重組蛋白含量 考馬斯亮藍(lán)法［23］，以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 平均比生長(zhǎng)速率［24］

其中μ是平均比生長(zhǎng)速率(1/h)，C是菌體濃度(g/L)，t是時(shí)間(h)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的分批發(fā)酵

重組大腸桿菌分批發(fā)酵的結(jié)果如圖1所示，由圖中可以看出，在葡萄糖濃度為10g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，重組大腸桿菌的菌體密度在12h達(dá)到最大，OD600為10.83，發(fā)酵結(jié)束后按照分析方法1.3.2測(cè)定細(xì)胞濃度(DCW)達(dá)5.95g/L。在第5h加入IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，誘導(dǎo)表達(dá)6h后取發(fā)酵液制取粗酶液，重組大腸桿菌進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵進(jìn)行24h后結(jié)束發(fā)酵，制取粗酶液，測(cè)定酶活達(dá)4.81U/mL。

圖1 重組大腸桿菌的分批發(fā)酵Fig.1 Batch fermentation of recombinant E.coli

2.2 重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵

重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果如圖2，由圖2(A)可以看出，當(dāng)補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為60g/L時(shí)，補(bǔ)料前平均比生長(zhǎng)速率為0.44h-1，補(bǔ)料期間平均比生長(zhǎng)速率僅為0.02h-1，在第14h菌體密度達(dá)到最大，OD600僅為11.99，與分批發(fā)酵相比沒(méi)有一點(diǎn)提高。這說(shuō)明補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度過(guò)低，培養(yǎng)基中碳源濃度嚴(yán)重不足，菌體生長(zhǎng)緩慢。因此，增大補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡糖糖的濃度，以提高發(fā)酵液中葡萄糖的濃度，分別設(shè)計(jì)了補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為90、120、150g/L，并在補(bǔ)料時(shí)手動(dòng)流加氨水溶液，培養(yǎng)結(jié)果如圖2(B)～圖2(D)所示。

由圖2(B)～圖2(D)可知，隨著補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增大，當(dāng)補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為90g/L時(shí)，補(bǔ)料前比生長(zhǎng)速率為0.44h-1，補(bǔ)料期間平均比生長(zhǎng)速率為0.060h-1;在第14h獲得細(xì)胞密度OD600值為33.75。當(dāng)補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為120g/L時(shí)，補(bǔ)料前比生長(zhǎng)速率為0.43h-1，補(bǔ)料期間平均比生長(zhǎng)速率為0.13h-1;在第22h獲得細(xì)胞密度OD600值為45.13。當(dāng)補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為150g/L時(shí)，料前比生長(zhǎng)速率為0.44h-1，補(bǔ)料期間平均比生長(zhǎng)速率為0.27h-1;在第24h獲得細(xì)胞密度OD600值為99.24。比較之后可以得出，補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為150g/L的結(jié)果最好。

2.3 IPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 誘導(dǎo)時(shí)間 在重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程，在誘導(dǎo)溫度為30℃，IPTG濃度為1mmol/L的情況下，分別在第 2、4、8、12、16h進(jìn)行誘導(dǎo)后，分批發(fā)酵30h，考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)褐藻膠裂解酶高效表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3所示。誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)基因表達(dá)效果影響很大，加入過(guò)早或過(guò)遲褐藻膠裂解酶基因的表達(dá)效果都不夠理想，過(guò)早的誘導(dǎo)時(shí)，微生物處于停滯期，IPTG的加入抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)，使得菌體密度較低;若誘導(dǎo)太晚，菌成熟后各種酶的合成能力降低，表達(dá)量也減少。由圖中可以看出，在第4h進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)效果最好，表達(dá)量達(dá)到最高值。發(fā)酵結(jié)束后制取粗酶液，酶活達(dá)17.62U/mL，重組蛋白含量達(dá)0.357g/g。

圖2 補(bǔ)料葡萄糖濃度對(duì)重組大腸桿菌分批補(bǔ)料發(fā)酵的影響Fig.2 Supplementary food glucose concentration on recombinant E.coli fed-batch culture fermentation

2.3.1.2 IPTG濃度 在重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程，在誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4h的情況下，分別以 IPTG 終濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分批發(fā)酵30h，考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)褐藻膠裂解酶高效表達(dá)的影響。結(jié)果如圖4所示，由圖中可以看出，第 4h以 IPTG終濃度為0.6mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)效果最好。發(fā)酵結(jié)束后制取粗酶液，酶活達(dá)17.62U/mL，重組蛋白含量達(dá)0.373g/g。當(dāng)大于0.6mmol/L時(shí)誘導(dǎo)效果開(kāi)始降低，這是由于高濃度的IPTG對(duì)含質(zhì)粒工程菌的生長(zhǎng)具有抑制作用［18］，并且IPTG本身價(jià)格就比較昂貴，因此控制好濃度是非常有必要的。

圖3 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Induction time of IPTG on recombinant protein expression

圖4 IPTG濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Concentration of IPTG on recombinant protein expression

2.3.2 單純形優(yōu)化法 單純形法在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，要先確定考察的因素，而且要等一個(gè)配方實(shí)驗(yàn)完后才能根據(jù)計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)，因此主要適用于實(shí)驗(yàn)周期較短的細(xì)菌或重組工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以及不能進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的優(yōu)化［25］。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單純形優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，利用均勻設(shè)計(jì)表構(gòu)造初始單純形，如表1所示，分別進(jìn)行重組大腸桿菌分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn);發(fā)酵結(jié)束后制備粗酶液，測(cè)定褐藻膠裂解酶酶活力，根據(jù)初始單純形實(shí)驗(yàn)結(jié)果，去掉其中結(jié)果最壞的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，按照改進(jìn)單純形優(yōu)化法確定出新的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG終濃度，其中新的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的計(jì)算公式為:P新=P平+α(P平-P差)，式中 P平為留下實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均值，P差為去掉的最差點(diǎn)，α的取值一般為1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)大或縮小。

表1 初始單純形Table 1 Initial simplex

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)5次更新單純形，即可確定出IPTG誘導(dǎo)的最優(yōu)條件，結(jié)果如表2所示，最佳誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)時(shí)間為第 4.5h，IPTG終濃度為0.60mmol/L。在此條件下，經(jīng)過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵，重組大腸桿菌經(jīng)過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵，在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)后，發(fā)酵進(jìn)行30h，最終菌體密度OD600達(dá)91.29，粗酶液的酶活達(dá)26.37U/mL，重組蛋白含量為0.491g/g，即為第7組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)酵液經(jīng)105℃烘干至恒重，稱(chēng)得其細(xì)胞干重為60.15g/L。與分批發(fā)酵相比，菌體密度提高了8.43倍，褐藻膠裂解酶的活性提高了5.48倍。

表2 誘導(dǎo)條件單純形優(yōu)化數(shù)據(jù)Table 2 Progress of simplex optimization for induction condition

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的優(yōu)化，使得發(fā)酵罐中葡萄糖的濃度既能供應(yīng)大腸桿菌的生長(zhǎng)，即能保持較高的比生長(zhǎng)速率，又能控制乙酸的產(chǎn)生，發(fā)酵罐中的pH保持在7.0左右，最終大腸桿菌發(fā)酵結(jié)束后菌體密度 OD600達(dá)99.24、細(xì)胞干重(g(DCW)/L)65.38的高密度。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和單純形優(yōu)化法優(yōu)化誘導(dǎo)條件，最終以最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)后，重組大腸桿菌在分批補(bǔ)料發(fā)酵中菌體OD600達(dá)91.29，細(xì)胞干重(g(DCW)/L)達(dá)60.15;褐藻膠裂解酶的酶活達(dá)26.37U/mL，是分批發(fā)酵的5.48倍。該方法補(bǔ)料指征簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的發(fā)酵參數(shù)控制和較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間，為以后的研究提供了一定的基礎(chǔ)。雖然與分批發(fā)酵相比，褐藻膠裂解酶的酶活得到了一定的提高，但仍然滿足不了生產(chǎn)使用的需求，以后仍然需要更加深入的研究，例如在酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)、蛋白質(zhì)工程等手段使其酶活進(jìn)一步提高。

［1］卜寧，馬蓮菊，劉詩(shī)揚(yáng)，等.兩種海洋寡糖對(duì)雙歧桿菌體外生長(zhǎng)作用的影響［J］.沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，27(4):472-475.

［2］陳麗，王淑軍，劉泉，等.褐藻寡糖對(duì)3種水產(chǎn)致病菌抗菌活性研究［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18(1):90-92.

［3］陳麗，張林維，薛婉立.褐藻寡糖的制備及抑菌性研究［J］.中國(guó)飼料，2007，42(9):34-35，42.

［4］江曉路，杜以帥，王鵬，等.褐藻寡糖對(duì)刺參體腔液和體壁免疫相關(guān)酶活性變化的影響［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，6:1188-1192.

［5］佟哲，王雪，卜寧，等.褐藻寡糖對(duì)熱應(yīng)激小鼠肝臟和胰腺的影響［J］.沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，25(4):487-490.

［6］Boyd A，Ghosh M，May TB，et al.Sequence of the algL gene of Pseudomonas aeruginosa and purification of its alginate lyase product［J］.Gene，1993，131:1-8.

［7］Schiller N L，Monday S R，Boyd C M，et al.Characterization of thePseudomonasaerugino0sa alginate lyase gene(algL):Cloning，sequencing，and expression inEscherichia coli［J］.Journal of Bacteriology，1993，175(15):4780-4789.

［8］Pecnia A，Pascual A，Paneque A.Cloning and expression of the algL gene，encoding the Azotobacter chroococcum alginate lyase:purification and characterization of the enzyme［J］.Journal of Bacteriology，1999，181(5):1409-1414.

［9］Ma Y，Xue L，Sun DW.Characteristics of trehalose synthase from permeablized Pseudomonas putida cells and its application in converting maltose into trehalose［J］.Journal of Food Engineering，2006，77:342-347.

［10］Osamu M-，Wataru H.An exotype alginate lyase in Sphingomonassp.A1:overexpression in Escherichia coli，purification，and characterization of alginate lyase IV(A1-IV)［J］.Protein Expression and Purification，2003，29:33-41.

［11］Malissard M，Chavagnat F，Duez C，et al.Overproduetion and Properties of the mannuronate alginate lyase AIXMB FEMS［J］.Mierobiol Lett，1995，126:105-112.

［12］劉巖，江曉路，管華詩(shī).褐藻膠裂合酶研究進(jìn)展［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2001，7(4):99-103.

［13］Schiller N L，Monday S R，Boyd C M，et al.Characterization of the Pseudomonas aeruginosa alginate lyase gene(algL):Cloning，sequencing，and expression in Escherichia coli［J］.Journal of Bacteriology，1993，175(15):4780-4789.

［14］李民，陳常慶.基因工程茵高密度發(fā)酵研究進(jìn)展［J］.生物工程進(jìn)展，2000，20(2):26-31.

［15］LeeS Y，Chang H N J.High cell-density culture of Escherichian coli［J］.Environ Polymer Degrad，1994，2:169-174.

［16］Jong H C，Ki Chang Keum，Sang Yap Lee.Production of recombinant proteins by High cell density culture of Escherichia coli［J］.Chemical Engineering Science，2006，61:876-885.

［17］楊利軍，楊濤，解軍，等.重組Echistatin融合基因工程菌高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2006，19(1):84-86.

［18］汪立平，劉玉佩，孫曉紅，等.褐藻膠裂解酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31(2):190-194.

［19］陳堅(jiān)，堵國(guó)成，張東旭.發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009:209.

［20］秦建侯，鄧勃，王小芹，等:分析測(cè)試中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，1986，5(1):50-56.

［21］寧正祥.食品成分分析手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997，72-81.

［22］Preiss J，Ashwell G.Alginic acid metabolism in bacteria.I.Enzymatic formation of unsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid［J］.Biochem，1962，237:309-316.

［23］凌沛學(xué)，張?zhí)烀?透明質(zhì)酸［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000:44-45.

［24］王英臣.菌體比生長(zhǎng)速率的酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究［J］.釀酒科技，2009，135(9):48-51.

［25］褚以文.微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法及其OPTI優(yōu)化軟件［J］.國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，1999，20(2):58-60，66.