周 佳，程 新，彭志遠，彭衛(wèi)福，李昆太

(江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045)

維生素B12系鈷胺素類(cobalamin)化合物，它是一種重要的生物活性物質，可以用來治療惡性貧血癥，同時它也是許多微生物和動物的生長因子［1］。由于維生素B12的化學合成步驟過于復雜，目前幾乎都是通過脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas denitrificans)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)和費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)等微生物的發(fā)酵來生產維生素B［2］12。由于維生素B12產率高，有關脫氮假單胞桿菌的應用研究更是成為人們當前所關注的熱點。脫氮假單胞桿菌生物合成維生素B12的過程共涉及八步甲基化反應［3］，盡管這些甲基化反應均是由S-腺苷-L-甲硫氨酸提供甲基參與完成，但是甲硫氨酸上的甲基往往來源于外源甲基供體。首先，甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸)在甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶(BetainehomocysteineS-methyltransferase，BHMT)的催化下向高半胱氨酸轉移一個甲基，分別形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸［4-5］;甲硫氨酸進一步通過甲硫氨酸腺苷轉移酶(methionine adenosyltransferase)催化形成S-腺苷-L-甲硫氨酸，所生成的S-腺苷-L-甲硫氨酸最終參與到維生素B12合成途徑中的甲基化反應過程。和甜菜堿一樣，氯化膽堿分子中也含有三個甲基［6］，它可逐步通過膽堿脫氫酶(choline dehydrogenase)和甘氨酸甜菜堿醛脫氫酶(glycine betaine aldehyde dehydrogenase)的催化生成甜菜堿，所生成的甜菜堿再進一步參與到S-腺苷-L-甲硫氨酸的合成反應中［7］。由此可見，在脫氮假單胞桿菌合成維生素B12的過程中，甜菜堿和氯化膽堿是十分重要的外源甲基供體。多項研究也表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入甜菜堿和氯化膽堿能夠大大促進脫氮假單胞桿菌合成維生素B［8-11］12。然而，目前很少有文獻報道這兩種典型性甲基供體會對脫氮假單胞桿菌的代謝過程產生怎樣的影響。基于此，本文在7L發(fā)酵罐中分別以甜菜堿和氯化膽堿為甲基供體，考察了這兩種甲基供體下的菌體代謝過程變化，結果發(fā)現(xiàn)二者會對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程產生截然不同的氧調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas denitrificans)由本實驗室保存;蔗糖、甜菜堿、氯化膽堿、5，6-二甲基苯并咪唑、CoCl2·6H2O、硫酸銨等試劑 均為國產分析純。

8453型紫外-可見分光光度計 Agilent公司;HP 1100型色譜儀 Agilent公司;7-L全自動發(fā)酵罐鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司等。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 20、玉米漿 10、(NH4)2SO40.25、(NH4)2HPO41.5、MnSO4·H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.1、瓊脂 20，pH7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30、玉米漿10、KH2PO45、(NH4)2SO42.3、(NH4)2HPO40.7、MnSO4·H2O 0.2、MgSO41.5、ZnSO4·7H2O 0.02、CoCl2·6H2O 0.02、5，6-二甲基苯并咪唑0.0045，pH7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖80、玉米漿30、甜菜堿/氯化膽堿 15、(NH4)2SO42、MgSO41.5、KH2PO40.75、ZnSO4·7H2O 0.08、CoCl2·6H2O，0.14、5，6-二甲基苯并咪唑 0.075，pH7.2～7.4。

1.3 發(fā)酵方法

1.3.1 斜面培養(yǎng) 從-20℃的冰箱中取出保藏好的甘油管菌種，接種于配制好的斜面，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

1.3.2 搖瓶種子培養(yǎng) 每支新鮮的斜面以10mL無菌水洗下菌體，制成菌懸液。取菌懸液1mL接至裝量為60mL/300mL三角瓶的種子培養(yǎng)基中，32℃在搖床上振蕩(260r/min)培養(yǎng)至菌體光密度值(OD700)為 9～10。

1.3.3 7-L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng) 將500mL菌體吸光值(乘以稀釋倍數(shù)后的OD700)為9～10左右的搖瓶種子接種值裝量為5L/7L罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為罐溫(32±0.5)℃、罐壓0.05～0.06MPa，通氣比1∶1(vvm)，攪拌轉速根據發(fā)酵過程的溶氧變化進行調整。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體生物量測定 采用測量菌體干重法(Dry cell weight，DCW)。吸取10mL發(fā)酵液至離心管中，5000r/min離心棄上清液，所得菌體以蒸餾水洗滌兩次，80℃下烘至恒重后稱量。

1.4.2 溶解氧測定 Mettler Toledo在線溶氧檢測系統(tǒng)。

1.4.3 pH測定 Mettler Toledo在線pH檢測系統(tǒng)。

1.4.4 維生素B12含量的測定:高效液相色譜法

a.樣品制備:取10mL發(fā)酵液，加入8%亞硝酸鈉溶液和冰醋酸各 2.5mL，搖勻，于 95～100℃水浴30min;水浴后冷卻至室溫，加去離子水定容至50mL，過濾;所得濾液用0.22μm微孔濾膜針頭過濾器過濾1mL至樣品瓶中，用微量進樣器吸取氰化鈉溶液20μL放入樣品瓶中，將樣品瓶放入35～40℃水浴中反應1h，使發(fā)酵液中不同形式的維生素B12轉化為氰鈷胺素，在給定條件下進行液相色譜分析;

b.高效液相色譜條件:流動相為250mmol/L磷酸水溶液-乙腈(30∶70，v/v);色譜柱為大連依利特Hypersil NH2柱(4.6mm ×250mm，5μm);檢測波長為361nm;進樣量是20μL;流速為1.7mL/min。

2 結果與討論

2.1 不同甲基供體對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵耗氧的影響

分別以氯化膽堿和甜菜堿為合成維生素B12的甲基供體，在7L發(fā)酵罐中考察了這兩種典型性甲基供體對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程耗氧的影響，結果如圖1所示。

圖1 氯化膽堿和甜菜堿為甲基供體下的轉速和溶氧的動態(tài)變化情況Fig.1 Time courses of agitation and DO under using choline chloride(a)and betaine(b)as methyl-donor for Pseudomonas denitrificans fermentation in 7L fermenter

由圖1所示的兩種甲基供體下的發(fā)酵過程溶氧變化趨勢可以看出，其發(fā)酵前期隨著菌體量不斷增加，耗氧量也隨之增大，均不得不通過提高攪拌轉速以增加供氧量。但是，當以氯化膽堿為甲基供體時，發(fā)酵液的溶氧在第76h后開始出現(xiàn)明顯的回升，這表明脫氮假單胞桿菌的代謝明顯變緩。此時，不得不通過降低攪拌轉速(由850r/min逐步降低到550r/min)來壓制溶氧的回升，但是發(fā)酵液的溶氧濃度仍然難以控制在適宜的水平。整個發(fā)酵過程不得不在第117h時結束，此時溶氧水平已高達64.6%。

而當以甜菜堿為甲基供體時，盡管攪拌轉速一直高達900r/min，但是脫氮假單胞桿菌整個發(fā)酵過程的溶氧濃度卻一直保持在3%～7%的范圍內，并沒有像使用氯化膽堿的發(fā)酵批次那樣出現(xiàn)明顯的溶氧回升現(xiàn)象。以上溶氧變化趨勢表明，脫氮假單胞桿菌在以甜菜堿為甲基供體進行發(fā)酵時，其代謝能力要明顯優(yōu)于使用氯化膽堿作為甲基供體的發(fā)酵批次。

2.2 不同甲基供體對脫氮假單胞桿菌菌體生長及產物合成的影響

當脫氮假單胞桿菌分別以氯化膽堿和甜菜堿為甲基供體進行發(fā)酵時，其發(fā)酵過程的溶氧濃度變化說明二者會對菌體的代謝能力產生一定的差異。為了深入了解這兩種甲基供體對脫氮假單胞桿菌代謝過程的影響，進一步測定了這兩個發(fā)酵批次下的pH、菌體生長和維生素B12合成等發(fā)酵參數(shù)的變化情況，結果如圖2所示。

圖2 氯化膽堿和甜菜堿作為甲基供體下的pH、菌體量和維生素B12產量等參數(shù)變化趨勢Fig.2 Time courses of pH，DCW and vitamin B12under using choline chloride(a)and betaine(b)as methyl-donor for Pseudomonas denitrificans fermentation in 7L fermenter

由圖2所示的pH變化可以看出，使用氯化膽堿為甲基供體的發(fā)酵批次，其發(fā)酵液的pH在第54h后出現(xiàn)劇烈的下降趨勢，pH在第96h時甚至降低至5.78。這很可能是由于氯化膽堿作為甲基供體被菌體利用后，致使氯離子不斷地積累，因而造成發(fā)酵液的pH出現(xiàn)明顯的下降。由于甜菜堿又名三甲基甘氨酸，屬于兩性化合物，水溶液一般呈中性［12］，因此該罐批下的pH變化較為穩(wěn)定，一直保持在7.15～7.50，并未像使用氯化膽堿的罐批那樣pH呈現(xiàn)劇烈的下降趨勢。

由圖2還可以看出，以氯化膽堿為甲基供體的罐批，其菌體量在第54h后表現(xiàn)出十分緩慢的增加趨勢，發(fā)酵過程的最大菌體干重僅為28.48g/L;而使用甜菜堿作為甲基供體的罐批，其菌體生長要明顯優(yōu)于使用氯化膽堿的罐批，發(fā)酵過程的最大菌體干重達到32.78g/L。

與菌體生長趨勢較為一致的是，甜菜堿作為甲基供體更有利于維生素B12的合成。該罐批放罐時(160h)的維生素 B12產量為146.2mg/L，而且在第120h時維生素B12合成量就達110.67mg/L，而以氯化膽堿為甲基供體的罐批在第117h時的維生素B12產量僅為75.49mg/L。

有研究表明，脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的溶氧濃度和pH會對維生素 B12的合成產生顯著的影響［13-14］。由于使用氯化膽堿作為甲基供體會造成脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程溶氧顯著回升以及pH劇烈下降，造成不利于菌體代謝的異常環(huán)境。然而使用甜菜堿為甲基供體的發(fā)酵過程，卻能將溶氧濃度和pH控制在適宜于維生素B12合成的范圍內。

3 結論

通過在7L發(fā)酵罐中考察使用氯化膽堿或甜菜堿作為甲基供體對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響，可以得出結論:使用氯化膽堿作為合成維生素B12的甲基供體時，發(fā)酵液pH會因氯離子的積累而出現(xiàn)明顯的下降趨勢，而且由于pH劇烈下降導致菌體生長和維生素B12合成受到抑制，最終因菌體代謝異常而造成發(fā)酵過程的溶氧過早回升，不得不提前放罐;而使用甜菜堿作為甲基供體時，發(fā)酵過程的pH能保持在較為適宜的范圍內，使得菌體代謝能力較使用氯化膽堿的罐批更為良好，因而沒有出現(xiàn)溶氧回升的現(xiàn)象，最終的維生素B12產量也更高。因此，在脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產維生素B12的過程中，宜選用甜菜堿作為外源甲基供體。

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