孫艷賓，陳洪基，姜國(guó)良

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海264210）

褐藻酸裂解酶的研究進(jìn)展

孫艷賓，陳洪基，姜國(guó)良

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海264210）

隨著海洋藥物和海洋保健制品的蓬勃發(fā)展，海洋多糖及其降解產(chǎn)物的研究也引起了廣泛的重視。利用褐藻酸裂解酶對(duì)褐藻酸進(jìn)行降解，獲得具有多種新型生物活性的海藻寡糖，已成為近幾年研究的熱點(diǎn)。該文介紹了褐藻酸裂解酶的來(lái)源、分類(lèi)、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及酶解機(jī)理，并對(duì)褐藻酸裂解酶的應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

褐藻酸；褐藻酸裂解酶；海藻寡糖

褐藻酸是由褐藻植物和某些細(xì)菌產(chǎn)生的直鏈多糖[1]，β-D-甘露糖醛酸（M）和其C5差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸（G）通過(guò)α-1,4-糖苷鍵結(jié)合形成3種褐藻酸分子：聚β-D-甘露糖醛酸（ployman-nuronicacid，PolyM）、聚α-L-古羅糖醛酸（polygulonichya-luronicacid，PolyG）和雜聚物（ployman nuronicacid and gulonichy aluronic acid，PolyMG）[2]。褐藻酸作為褐藻植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，在馬尾藻中的含量尤為豐富，另外某些假單胞菌也會(huì)分泌乙?；暮衷逅帷Ｉa(chǎn)褐藻酸的原料以泡葉藻、巨藻和人工養(yǎng)殖的海帶為主，也有少量的馬尾藻。由于褐藻酸具有金屬螯合和高粘滯性能，該多糖常作為穩(wěn)定劑、增稠劑和乳化劑廣泛應(yīng)用于食品、化工和制藥等領(lǐng)域[3]。褐藻酸也具有生物活性，如PolyM能誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[4]，相反PolyG能抑制白細(xì)胞分泌白介素和腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）[5]，在提高機(jī)體免疫力和治療免疫疾病等方面有良好的用途。

海洋天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)正方興未艾，褐藻酸裂解產(chǎn)物——海藻寡糖是目前研究最受關(guān)注的海洋活性物質(zhì)之一，海藻寡糖不僅有褐藻酸大分子的某些功能性質(zhì)，而且具有很多褐藻酸所不具備的獨(dú)特的生理活性和功能特性，如抗腫瘤[6]、誘導(dǎo)細(xì)胞因子[7]、抑菌活性[8]、降血壓[9]、抗凝血[10]、抗氧化[11]、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[12]等。褐藻酸的降解方法主要有化學(xué)降解法（酸堿處理、氧化降解）和酶降解法。褐藻酸酶降解法與化學(xué)降解法相比，具有反應(yīng)條件溫和，降解過(guò)程及產(chǎn)物分子質(zhì)量易控制，海藻寡糖活性高并且對(duì)環(huán)境無(wú)污染的特點(diǎn)，其研究具有深遠(yuǎn)的意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 褐藻酸裂解酶研究現(xiàn)狀

1.1 褐藻酸裂解酶來(lái)源

1931年，有學(xué)者從鮑魚(yú)內(nèi)臟中分離出了褐藻酸裂解酶，研究人員陸續(xù)從海洋動(dòng)物、海洋藻類(lèi)和微生物中發(fā)現(xiàn)了褐藻酸裂解酶。其中產(chǎn)褐藻酸裂解酶的微生物種類(lèi)復(fù)雜，分布廣泛，是目前研究最多的一類(lèi)。海洋細(xì)菌和土壤細(xì)菌是最主要的來(lái)源（如黃桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、腸桿菌、克雷伯氏菌、弧菌等）。少數(shù)的真菌和病毒也存在褐藻酸裂解酶基因，SINGHRP等[13]從網(wǎng)地藻附近的一株米曲霉（Aspergillus oryzae）中純化出了褐藻酸裂解酶，該酶能專一性識(shí)別PolyM和PolyG之間的β-1,4糖苷鍵，Co2+和Na+能明顯提高酶的活性。DAVIDSON I W等[14]發(fā)現(xiàn)固氮菌（Azotobacter vinelandii）的噬菌體誘導(dǎo)產(chǎn)生PolyM裂解酶，對(duì)固氮菌褐藻酸被膜有很強(qiáng)的穿透作用。不同來(lái)源褐藻酸裂解菌的褐藻酸裂解酶酶學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 不同來(lái)源褐藻酸裂解菌的褐藻酸裂解酶酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Enzymatic properties of alginate lyase from different sources of alginate lysis bacteria

1.2 褐藻酸裂解酶分類(lèi)

按分子質(zhì)量的大小，褐藻酸裂解酶主要分為三大類(lèi)：20～35ku[26-28]、40ku、60ku[29]。分子質(zhì)量40ku的酶類(lèi)對(duì)PolyM具有特異性，分子質(zhì)量20～35ku的酶類(lèi)有不同的底物特異性。

按照底物特異性，褐藻酸裂解酶被分為：專一性裂解PolyM的PolyM裂解酶，如來(lái)自銅綠假單胞菌[25]、固氮菌[30-31]等的褐藻酸裂解酶；專一性裂解PolyG的PolyG裂解酶，如來(lái)自陰溝腸桿菌[32]、弧菌510[33]等的褐藻酸裂解酶，以及能同時(shí)裂解PolyM和PolyG的雙功能裂解酶。鞘氨醇單胞菌菌種Sphingomonassp.A1產(chǎn)生三種褐藻酸內(nèi)切酶（A1-I，A1-II，和A1-III），這些酶表現(xiàn)出不同的底物特異性：A1-II特異性降解褐藻酸PolyG，A1-III能特異性降解綠膿桿菌產(chǎn)生的乙酰化褐藻酸PolyM，而A1-I同時(shí)具有A1-II和A1-III的特性。

碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（carbohydrate-activeenzymes，CAZY）根據(jù)氨基酸序列將多糖裂解酶劃分到22個(gè)多糖裂解酶類(lèi)（polysaccharide lyases，PLs）家族中。PLs是一類(lèi)專一性識(shí)別多糖的糖醛酸殘基，通過(guò)β-消去反應(yīng)在非還原性末端形成含有C=C雙鍵的不飽和寡糖的酶家族，可細(xì)化為24個(gè)家族，褐藻酸裂解酶分布在其中的7個(gè)家族中。大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶屬于PL-5和-7家族，分別具有PolyM裂解酶和PolyG裂解酶的特性，小球藻病毒和海洋動(dòng)物產(chǎn)生的酶屬于PL-14家族。大多數(shù)報(bào)道的褐藻酸具有內(nèi)切酶的活性，兩種新發(fā)現(xiàn)的褐藻酸裂解酶菌株Sphingomonas sp.A1產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶A1-IV和A.Tumefaciens產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶Atu3025具有外切酶的活性，被劃分到PL-15家族，其他5個(gè)家族的酶具有內(nèi)切酶活性。

1.3 褐藻酸裂解酶的結(jié)構(gòu)

X-射線晶體學(xué)分別對(duì)菌株Sphingomonassp.A1產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶A1-III（來(lái)自PL-5家族），菌株Corynebac teriumsp.產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶（alginate lyases-1，ALY-1）（來(lái)自PL-7家族）和菌株A.tumefaciensC58產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶Atu3025（來(lái)自PL-5家族）進(jìn)行了空間結(jié)構(gòu)的分析。A1-III的空間結(jié)構(gòu)是由12條α-螺旋組成的（α6/α5）-桶狀超二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，不存在β-折疊，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與葡萄糖淀粉酶和纖維素酶中的（α6/α6）-桶狀結(jié)構(gòu)相似[34]。A1-III分子中有一個(gè)管狀的裂縫區(qū)域，褐藻酸分子滲入其中與催化殘基發(fā)生相互作用。

PL-7家族的ALY-1裂解酶與A1-III裂解酶的空間結(jié)構(gòu)完全不同，ALY-1是由14條β-折疊股形成的2個(gè)反向平行β-折疊（βI：β2、β1、β5、β14、β7、β8、β9、β10和βII：β4、β15、β6、β11、β12、β3）和2個(gè)α-螺旋組成，稱為β-sandwich結(jié)構(gòu)蛋白，與β-葡聚糖酶的β-jellyroll結(jié)構(gòu)相似。多重序列分析結(jié)果表明PL-5和PL-7家族的序列相似性相對(duì)較低。然而，ALY-1和A1-III裂解酶都有一個(gè)包含底物結(jié)合位點(diǎn)的裂縫區(qū)域，裂縫中心的酪氨酸、組氨酸、精氨酸和天冬酰胺（或谷氨酰胺）殘基空間排列極為相似且高度保守，兩者可能是兩種蛋白分子趨同進(jìn)化的結(jié)果，這些高度保守的氨基酸對(duì)裂解酶的催化活性有重要作用。

圖1 A1-III/ALY-1的空間結(jié)構(gòu)(a)和催化殘基(b)Fig.1 Spatial structure(a)and catalytic residues(b)of A1-III/ALY-1

PL-15為褐藻酸外切酶家族，與其他家族的裂解酶沒(méi)有同源性。A.tumefaciensC58的Atu3025通過(guò)外切作用在底物末端形成不飽和單糖，該酶由776個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為87 ku。Atu3025以α-α-barrel結(jié)構(gòu)和反向平行的β-折疊作為基本支架，其折疊方式也與其他褐藻酸裂解酶有很大的差異。OCHIAI A等[35]利用定點(diǎn)誘變的方法研究了Atu3025的酶促反應(yīng)機(jī)理，α-α-barrel結(jié)構(gòu)域中心存在一條較短的α-螺旋，該α-螺旋的構(gòu)象在α-α-barrel結(jié)構(gòu)域中心和C-末端結(jié)構(gòu)域之間的界面上發(fā)生改變，這兩個(gè)條件是Atu3025具備外切酶活性必不可少的結(jié)構(gòu)因素。

1.4 褐藻酸酶解機(jī)理

1987年，GACESA P等[36]提出褐藻酸的酶解機(jī)理，褐藻酸裂解酶催化褐藻酸分子發(fā)生β-消去反應(yīng)斷裂4-O-糖苷鍵，在C4、C5之間形成雙鍵，并在產(chǎn)物海藻寡糖的非還原性末端形成一個(gè)4-脫氧-L-赤-己-4-烯吡喃糖醛酸酯的不飽和單體，該單體在波長(zhǎng)235 nm處有強(qiáng)吸收峰[37]。隨后，GACESA P等[38]將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向褐藻酸裂解酶的作用機(jī)制，該機(jī)制包括三步反應(yīng)：a.精氨酸和天冬酰胺中和羧基上的負(fù)電荷；b.通過(guò)廣義酸堿催化，酪氨酸獲取C5位上的質(zhì)子；c.酪氨酸釋放質(zhì)子在C4與C5之間形成雙鍵，導(dǎo)致4-O-糖苷鍵斷裂，最終將褐藻酸分子裂解為一分子海藻寡糖和一分子不飽和單糖。

1.5 褐藻酸裂解酶在褐藻酸生物合成/降解中的功能

褐藻酸裂解酶在產(chǎn)褐藻酸的生物中具有重要的作用。綠膿桿菌P.aeruginosa是一種可以合成褐藻酸的機(jī)會(huì)性致病菌，常引起囊性纖維癥（cystic fibrosis，CF）患者的肺部感染，褐藻酸被膜能有效抵擋宿主免疫系統(tǒng)和抗生素對(duì)綠膿桿菌的威脅。綠膿桿菌也可以產(chǎn)生褐藻酸裂解酶AlgL，在褐藻酸合成過(guò)程中，AlgL能調(diào)節(jié)褐藻酸聚合物的長(zhǎng)度[39]并引導(dǎo)褐藻酸穿越胞外周質(zhì)[40]。同時(shí)，AlgL也能通過(guò)降解褐藻酸被膜加快綠膿桿菌的擴(kuò)散[41]。

圖2 Sphingomonassp.A1胞內(nèi)褐藻酸的降解途徑Fig.2 Degradation pathway of alginic acid from the cell of Sphingomonassp.A1

大多數(shù)褐藻酸裂解菌產(chǎn)胞外褐藻酸裂解酶，褐藻酸首先在胞外降解，小分子海藻寡糖及單糖等降解產(chǎn)物再轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)進(jìn)行代謝。然而，有些褐藻酸裂解菌（如Sphingomonassp. A1）可以直接攝取褐藻酸大分子。Sphingomonassp.A1是國(guó)內(nèi)外研究最全面的一株鞘氨醇假單胞菌，細(xì)胞膜上存在一個(gè)稱為“super-channel”的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。當(dāng)菌體周?chē)嬖诤衷逅釙r(shí)，胞膜褶結(jié)構(gòu)重排或流動(dòng)形成的“pit”結(jié)構(gòu)將褐藻酸聚集濃縮，在褐藻酸結(jié)合蛋白AlgQ1/AlgQ2和ATP結(jié)合盒引導(dǎo)下褐藻酸分子進(jìn)入胞內(nèi)。Sphingomonassp.A1的褐藻酸內(nèi)切酶A1-I、A1-II和A1-III將褐藻酸降解為二糖、三糖和四糖，A1-IV具有外切酶活性，能將產(chǎn)生的海藻寡糖降解成不飽和糖醛酸，隨后在有關(guān)酶系催化下轉(zhuǎn)化為丙酮酸和甘油醛-3-磷酸。Sphingomonassp.A1胞內(nèi)褐藻酸的降解途徑如圖2所示。

2 褐藻酸裂解酶的應(yīng)用

不同來(lái)源的褐藻酸裂解酶在特異性、酶切方式和反應(yīng)條件等方面有明顯的差異，酶解產(chǎn)物海藻寡糖（含有3～25個(gè)糖醛酸單體）表現(xiàn)出眾多不同的生物活性，如促進(jìn)人體巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，抗凝血，抑制腫瘤生長(zhǎng)等功能。研究發(fā)現(xiàn)，海藻寡糖的活性與分子質(zhì)量大小、組成以及寡糖鏈的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

在綠膿桿菌引起的CF患者肺部感染治療上，2012年諾華公司開(kāi)發(fā)的一種吸入式妥布霉素對(duì)患者的癥狀有一定的緩解，然而單一的抗生素會(huì)引起綠膿桿菌的抗藥性。A1-III降解綠膿桿菌乙酰化的PolyM被膜，與抗生素配合治療能從根本上殺滅綠膿桿菌。A1-III本身的抗原性很難直接作為藥物應(yīng)用于臨床，有關(guān)研究嘗試?yán)镁垡叶夹揎椃暗鞍踪|(zhì)工程技術(shù)[42]對(duì)A1-III進(jìn)行修飾，抗原性有不同程度的降低或消失而且仍然保持較高的酶活力。

褐藻酸裂解酶還廣泛應(yīng)用于海藻原生質(zhì)體的制備、控制多糖流變特性、清理污水生物膜和褐藻酸微細(xì)結(jié)構(gòu)分析等。隨著第三代生物燃料—“藻時(shí)代”的來(lái)臨，褐藻酸裂解酶還將在海藻的糖化技術(shù)中發(fā)揮作用。

3 總結(jié)與展望

作為最重要的海洋工具酶之一，目前已有60多種不同來(lái)源的褐藻酸裂解酶被分離純化。然而，現(xiàn)有的產(chǎn)酶菌株普遍存在酶活性和產(chǎn)量較低的問(wèn)題，較難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用要求，酶基因的異源表達(dá)已成為獲得高產(chǎn)褐藻酸裂解酶的主要手段。在酶的制備和研究中，加深菌株褐藻酸裂解酶表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式和酶與底物作用機(jī)理等問(wèn)題的認(rèn)識(shí)，將為褐藻酸裂解酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Research progress of alginate lyase

SUN Yanbin,CHEN Hongji,JIANG Guoliang
(Shangdong Drug and Food Vocational College,Weihai 264210,China)

With the vigorous development of marine drugs and marine health products,the research of marine polysaccharide and its degradation products is focused on bioactive function.Alginate lyase can degrade alginate into alginate oligosaccharides(AOs),and the research on the AOs with multi new-type biological activities has become a research hotspot recently.The origin,classification,structure,biological function and enzymatic hydrolysis mechanism of alginate lyase were presented,and the application and prospects of alginate lyase were discussed as well.

alginic acid;alginate lyase;seaweed oligosaccharides

Q93

0254-5071（2017）03-0014-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.004

2016-10-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31101876）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010DQ012）

孫艷賓（1990-），女，助教，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與海洋生物活性物質(zhì)。