李潤靜，張 濤，江 波，沐萬孟，繆 銘

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

果聚糖(Levan)是一種以蔗糖為底物由果聚糖蔗糖酶(levansucrases，EC2.4.1.10)催化轉(zhuǎn)移果糖殘基到蔗糖的碳鏈上，促進碳鏈延伸，形成的β-2，6-果聚糖(圖1)［1］。果聚糖結(jié)構(gòu)上的特異性決定了它的性能不同于大多數(shù)天然聚合的多糖。果聚糖具有促進雙歧桿菌增殖，改善腸道微環(huán)境;降低膽固醇和脂肪的吸收;調(diào)節(jié)血糖水平，降低糖尿病引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理功能。此外，果聚糖還具有保濕作用，可以應(yīng)用于化妝品中。果聚糖蔗糖酶是糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，它除了具有轉(zhuǎn)糖基活性，還有水解活性，可以將蔗糖水解為葡萄糖和果糖。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的微生物主要為細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［2］、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)［3］、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)［4］、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)［5-6］、 金 山 乳 桿 菌 (Lactobacillus sanfranciscensis)［7-8］、腸 膜 明 串 珠 菌 (Leuconostoc mesenteroides)［9］、丁 香 假 單 胞 桿 菌 (Pseudomonas syringae)［10］、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)［11］等。但它們產(chǎn)果聚糖的能力差別很大，產(chǎn)量大約在1～40g/L之間，其中大部分產(chǎn)量偏低。目前研究主要集中在微生物發(fā)酵產(chǎn)果聚糖上，而對發(fā)酵產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的研究較少，然而用生物發(fā)酵法直接生產(chǎn)果聚糖會使果聚糖的后期純化分離難度加大［12］。本研究主要針對本實驗室篩選到的一株高產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的新菌株進行發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化，為進一步研究利用果聚糖蔗糖酶生產(chǎn)果聚糖奠定基礎(chǔ)，這樣通過果聚糖蔗糖酶與蔗糖直接反應(yīng)，會簡化后期果聚糖的分離純化。

圖1 果聚糖結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure chart of levan

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲基營養(yǎng)芽孢桿菌 SK21.002(Bacillus methylotrophicus SK 21.002)實驗室篩選獲得，前期工作中已鑒定該菌可以產(chǎn)生果聚糖蔗糖酶;種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖20，酵母提取物10，魚粉蛋白胨5，K2HPO44.5，pH7.5;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):同種子培養(yǎng)基。

高速冷凍離心機 德國eppendorf centrifuge 5804R;高效液相色譜儀 美國Agilent 1200;色譜分離柱 美國WATERS公司SugarparkⅠ;檢測器 日本Shodex示差折光檢測器。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 取生長良好的斜面菌種2環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃ 160r/min下培養(yǎng)15h得到種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將活化的種子液按體積分?jǐn)?shù)2%接到裝有20%(v/v)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃160r/min，振蕩培養(yǎng)24h。

1.2.3 粗酶液的制備 取30mL發(fā)酵液冷凍離心(4℃，7500r/min，15min)，所得菌體用去離子水洗滌兩次，重新振蕩懸浮于25mL磷酸緩沖溶液(pH6.0，20mmol/L)中，冰水浴超聲破碎12min，最后將破碎的細(xì)胞液冷凍離心(4℃，10000r/min，10min)，取上清液即為粗酶液。

1.2.4 酶活力測定方法 將0.5mL 20%(w/v)的蔗糖溶液與0.5mL粗酶液在pH6.0、20mmol/L的磷酸鹽緩沖體系下混合均勻，在40℃水浴下反應(yīng)20min，最后沸水浴煮沸10min終止反應(yīng)，用高效液相法測定果糖、葡萄糖的生成量，確定酶活。色譜條件為:色譜柱:SugarparkⅠ鈣型柱;柱溫:85℃;流動相:純水(經(jīng) 0.45μm膜過濾);流速:0.4mL/min;上樣體積:10μL。

果聚糖蔗糖酶酶活定義為:將40℃，pH6.0條件下每分鐘轉(zhuǎn)移1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個果聚糖蔗糖酶活力單位。

1.2.5 菌體生物量測定 采用細(xì)胞光密度(OD600nm)分析法:取發(fā)酵液適量，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尯?，采用分光光度法測定OD值。

OD600nm=OD600讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.6 單因素實驗 依次改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源、氮源、金屬離子，確定合適的發(fā)酵培養(yǎng)基組成，然后研究發(fā)酵培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量、裝液量和培養(yǎng)時間)對菌體生物量和果聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響。

1.2.7 正交實驗 選取蔗糖、酵母提取物、胰蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、NaCl 6 個因素，采用 6 因素 3 水平的正交表(L18(36))設(shè)計實驗，優(yōu)化條件的因素水平如表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響

2.1.1 碳源對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 改變起始發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源的種類，分別以20g/L的葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉、甘油和菊糖作為唯一碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。從圖2可以看出，在所用碳源中，以甘油為碳源時菌體的生長量最大，但產(chǎn)酶能力較低;在以蔗糖為碳源時菌體的生長良好，且對產(chǎn)酶的促進最明顯。這可能是由于蔗糖作為該酶催化反應(yīng)的底物對產(chǎn)酶有一定的誘導(dǎo)作用，這一結(jié)果與Karima［12］研究結(jié)果一致。故選用蔗糖作為碳源做進一步研究。

表1 正交實驗因素水平表(g/L)Table 1 Factors and their levels in orthogonal array design(g/L)

圖2 不同碳源對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on biomass and levansucrase production

2.1.2 蔗糖濃度對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 將種子液分別接種于含有不同蔗糖濃度(20、50、80、100、150、200、250、300、350、400g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。

當(dāng)蔗糖濃度在20～80g/L范圍內(nèi)時菌體生物量隨著蔗糖濃度的增大而增大，之后隨著蔗糖濃度繼續(xù)增大菌體產(chǎn)量逐步下降。酶的產(chǎn)量變化也呈現(xiàn)相同的趨勢，分析出現(xiàn)這種趨勢的原因可能為:較高的蔗糖濃度會抑制菌體的生長。故選擇蔗糖濃度80g/L做進一步研究。

圖3 蔗糖濃度對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of sucrose concentration on biomass and levansucrase production

2.1.3 氮源對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 分別以15g/L的NaNO3、NH4NO3、尿素、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母提取物等為無機或有機單一氮源，以及復(fù)合氮源酵母提取物+魚粉蛋白胨、酵母提取物+胰蛋白胨(2∶1，w/w)，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進行最佳氮源篩選。實驗結(jié)果如圖4所示，甲基營養(yǎng)芽孢桿菌對無機氮源的利用率很低，菌體產(chǎn)量和酶產(chǎn)量均很低;而采用有機氮源時菌體和酶的產(chǎn)量都較高，其中采用復(fù)合有機氮源酵母提取物和胰蛋白胨時菌體和酶的產(chǎn)量都達到最大值。故選用復(fù)合有機氮源酵母提取物和胰蛋白胨作為氮源做進一步研究。

圖4 氮源對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on biomass and levansucrase production

2.1.4 金屬離子對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 微生物生長繁殖和產(chǎn)物合成中需要供給無機鹽和微量元素，如硫、鎂、鈣、鋅、鉆、鉀、鈉、錳等，作為其生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)物。這些物質(zhì)一般在低濃度時對微生物生長和產(chǎn)物合成有促進作用，在高濃度時常表現(xiàn)出明顯的抑制作用。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.8g/L 的 BaCl2、CaCl2、CuCl2、FeSO4、KCl、MgSO4、MnCl2、NaCl、ZnCl2進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，以只添加磷酸鹽的培養(yǎng)基作為對照，考察金屬離子對產(chǎn)酶的影響。由圖5可以看出，Mg2+對菌體生長和產(chǎn)酶有顯著的促進作用，這可能是因為Mg2+一般是微生物代謝路徑里很多酶的激活劑，能促進糖代謝、核酸合成、磷酸鹽轉(zhuǎn)化等。另外Na+和K+對產(chǎn)酶也有一定的促進作用，而 Ba2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+對菌體的生長和產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。但Karima對一株Bacillus sp.研究顯示Fe2+對產(chǎn)酶有顯著促進作用［12］，可知果聚糖蔗糖酶的微生物來源不同對金屬離子的依賴性也不同。由此確定，選取Mg2+、Na+和K+做進一步研究。

圖5 金屬離子對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of metal ions on biomass and levansucrase production

2.2 正交實驗

比較本實驗中 A、B、C、D、E、F 6個因素中 R 值的大小，可以看出C因素，即胰蛋白胨含量為重要因素，其次是D因素，即K2HPO4含量，再者是A因素，即蔗糖濃度，而E因素，即MgSO4濃度為不重要因素。6個因素的主次關(guān)系是:C＞D＞A＞B＞F＞E。

根據(jù)各因素的最好水平選取A2B1C2D3E3F3為最優(yōu)組合，即蔗糖80g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO48g/L，MgSO41g/L，NaCl 2g/L。經(jīng)多次驗證，用此培養(yǎng)基進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)21h后產(chǎn)酶活力可達9.76U/mL。

2.3 培養(yǎng)條件對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響

2.3.1 培養(yǎng)溫度對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 溫度可以影響微生物體內(nèi)的許多反應(yīng)，進而影響微生物的代謝活動。在一定溫度范圍內(nèi)，生化反應(yīng)速率隨溫度上升而加快;但當(dāng)溫度過高時，細(xì)胞功能下降以至死亡。為進一步研究培養(yǎng)溫度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響，將接種的發(fā)酵培養(yǎng)基分別在 26、28、30、32、34、36℃條件下進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于30℃時菌體生長量和產(chǎn)酶量隨溫度的升高而增大，30℃時兩者的產(chǎn)量都達到最大值，高于30℃時兩者產(chǎn)量都會受到抑制，故選擇最適發(fā)酵溫度為30℃。

2.3.2 初始pH對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，實驗結(jié)果如圖7所示，當(dāng)初始pH低于6.5時，菌體生長量和產(chǎn)酶量隨pH的增大而增大，pH6.5時菌體生長量和產(chǎn)酶量均達到最大值，但菌體的生長量在pH6.5左右變化不明顯。目前報道的果聚糖蔗糖酶的最適pH大部分集中于5～6.5之間［12-13］，故選擇初始pH6.5做進一步研究。

2.3.3 裝液量對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 搖瓶裝液量的變化反映了溶氧水平的變化和營養(yǎng)的供應(yīng)量。參考《伯杰氏手冊》知，芽孢桿菌多數(shù)是好氧菌或者兼性厭氧菌，故在固定搖床轉(zhuǎn)速160r/min的條件下，研究了250mL三角瓶中裝液量10%～40%范圍內(nèi)菌體的生長量和產(chǎn)酶情況。由圖8可以看出，在裝液量低于35%時，菌體的生長隨著裝液量的增加而增大，當(dāng)裝液量大于35%時，菌體的生長量下降。同時裝液量對產(chǎn)酶量也有顯著影響，在30%的裝液量時，酶合成最為旺盛，而在高于30%的裝液量時酶的合成會受到抑制。故選擇裝液量30%做進一步研究。

表2 正交實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design scheme and experimental results

圖6 培養(yǎng)溫度對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of temperature on biomass and levansucrase production

圖7 初始pH對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on biomass and levansucrase production

2.3.4 接種量對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 接種量對微生物的生長和代謝有一定的影響，合適的接種量對于縮短菌體在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長延滯期，提高產(chǎn)率有著重要的影響。在其他條件相同的情況下，改變接種量，研究接種量對菌體生長量和產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖9所示，接種量在1%～3%之間時，無論是菌體的生長量，還是產(chǎn)酶量都較高，之后隨著接種量的增加兩者的產(chǎn)量均略有降低，故選擇接種量2%為最適接種量。

2.3.5 發(fā)酵時間對甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的影響 從圖10中可以看出，在0～48h的發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)量和酶產(chǎn)量都出現(xiàn)較明顯變化，但二者的變化趨勢基本一致，這可能是因為本文所研究的果聚糖蔗糖酶為胞內(nèi)酶，故菌體量的多少會直接影響酶的產(chǎn)量。在0～21h之間菌體的生長量和酶產(chǎn)量呈明顯上升趨勢，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，菌體生長量和酶產(chǎn)量會逐漸降低。這主要因為隨著發(fā)酵時間的延長培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)減少，有害代謝產(chǎn)物增加，菌體生長進入衰亡期。因此，確定最佳發(fā)酵時間為21h。

圖8 裝液量對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of liquid medium volume on biomass and levansucrase production

圖9 接種量對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of inoculation on biomass and levansucrase production

圖10 發(fā)酵時間對生物量和產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of time on biomass and levansucrase production

3 結(jié)論

對實驗室篩選、保藏的甲基營養(yǎng)芽孢桿菌SK21.002產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的條件進行了單因素實驗和正交實驗優(yōu)化，確定了最適產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基為:80g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO48g/L，MgSO41g/L，NaCl 2g/L;最適產(chǎn)酶發(fā)酵條件為:初始 pH6.5，發(fā)酵溫度30℃，裝液量30%，接種量2%，發(fā)酵周期21h。在該培養(yǎng)條件下所產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的酶活達到9.76U/mL，約為優(yōu)化前的3.75倍，酶的產(chǎn)量得到了很大提高，為下一步利用果聚糖蔗糖酶生產(chǎn)果聚糖奠定了基礎(chǔ)。

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