李成海，贠建民，艾對元，張紊瑋，顏東方

(甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

隨著食品工業(yè)的快速增長，人們對食品防腐劑的安全性以及食品的保質期問題提出了更高的要求。一些食品腐敗菌如金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)等嚴重危害著食品安全，如何防止食品腐敗變質及開發(fā)安全的食品防腐劑越來越受到重視。研究表明，一些化學合成防腐劑存在一定的安全隱患，如苯甲酸鹽可能會引起食物中毒現(xiàn)象，硝酸鹽和亞硝酸鹽可能會生成致癌的亞硝胺［1］。而微生物防腐劑如Nisin、Natamycin等因其安全性高、性能好，而且不影響食品風味，在食品防腐方面具有很高的應用價值［2］。因此，開發(fā)安全、高效、健康的新型微生物防腐劑成為當今食品工業(yè)發(fā)展的趨勢。從極端生境中分離具有活性功能的微生物已越來越受到重視。目前有研究已經(jīng)從干旱生境中篩選出具有活性功能的微生物［3］，如能產生纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的沙漠放線菌產抗癌菌素濕性鏈霉菌(Streptomyces humidus subsp.Antitumoris)、達松威爾擬諾卡菌(Nocardiopsis dassonvillei)和易變鏈霉菌(Streptomyces mutabilis)，以及產胞外多糖高達7445.80mg/L的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)［4］。為此，本實驗擬以甘肅中部干旱生境土壤為分離材料，開展拮抗金黃色葡萄球菌的菌株篩選，旨在為構建和豐富防腐微生物種質資源庫提供菌種來源，為相關企業(yè)開發(fā)微生物防腐劑新產品提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 土樣來源 從甘肅中部定西市干旱北山山坡，用滅過菌的鏟子除去表面1～2cm的土層，以表層下3～4cm深度為基準采集土樣，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌株 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、表皮葡萄球菌 (Stapyloccocush epidermidis)均由甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院微生物實驗室保藏;結核分歧桿菌(Mycobacterium tuberculosis)由蘭州大學醫(yī)學院微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 高氏1號培養(yǎng)基，用于樣品中細菌的分離;牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，用于拮抗細菌的活性菌株篩選;牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，作為指示菌的活化及發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.4 主要實驗儀器 SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化;YX-280A高壓滅菌鍋 上海三申;HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠;THZ-82N臺式恒溫振蕩器 上海躍進;PB203-N電子天平 上海精密科學儀器廠;XP-200顯微鏡上海繪統(tǒng)光學儀器有限公司;PCR反應擴增儀 加拿大BBI公司;3730測序列分析儀 美國ABI公司;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司;DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海琪特分析儀器有限公司;YXJ-2離心機 湘儀離心機儀器有限公司;H6-1微型電泳槽 上海精益有機玻璃制品儀器廠;凝膠成像系統(tǒng) Gene Genius公司;移液器 加拿大BBI公司。

1.2 菌株的分離、純化［5］

稱取研細土樣5g，加入盛有45mL無菌水的三角瓶中，搖床振蕩20min。吸取1mL土壤懸浮液到9mL無菌水中稀釋得10倍液，依次按10倍法稀釋到10-6一系列稀釋液。分別取10-4、10-5和10-6稀釋液0.2mL，用涂布平板法均勻接種到高氏1號培養(yǎng)基上，每個處理三個重復。將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4～7d。挑取單菌落，分離純化后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 指示菌的活化 將各供試指示菌斜面菌苔分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)36h;連續(xù)培養(yǎng)3～4代種子液，用無菌水稀釋至濃度為107CFU/mL［6］的菌懸液，制備長有指示菌的營養(yǎng)固體平板。

1.3.2 拮抗菌株的初篩 采用點接法篩選。將分離出的菌株分別點接在涂有指示菌的營養(yǎng)固體平板上，每個平板三個重復，以未涂指示菌的平板為對照，培養(yǎng)72h，觀察抑菌情況。

1.3.3 拮抗菌株的復篩 發(fā)酵液的制備［7］:將拮抗菌在無菌條件下接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)5d;發(fā)酵液在4500r/min離心15min后，取上清液，備用。

參照馬永全等［8］的方法，取已滅菌的牛津杯置于涂有指示菌的平板上，吸取拮抗菌發(fā)酵液0.3mL滴加于牛津杯中，每個平板放3個牛津杯，設空白對照，培養(yǎng)24h，觀察抑菌情況。并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，計算抑菌效價。

式中:X為抑菌圈直徑(mm);Y為牛津杯直徑:8mm;V為發(fā)酵液體積(μL)。

1.3.4 抑菌最低濃度稀釋梯度的測定 吸取1mL待測菌發(fā)酵液到9mL無菌水中稀釋得10倍液，依次按10倍法稀釋到10-7一系列稀釋液。分別對各梯度發(fā)酵液通過牛津杯法對指示菌進行抑菌實驗，每個平板放3個牛津杯，并設置空白對照，培養(yǎng)24h，觀察抑菌情況。

1.4 拮抗菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學特征 用接種針挑取拮抗菌菌苔少許進行涂片，然后用酒精燈加熱固定，對固定好的菌株采用美藍染液染色1min，水洗后干燥，鏡檢。

革蘭氏染色［9］:用接種針挑取拮抗菌菌苔少許涂片固定;用草酸銨結晶紫染1min，水洗;加碘液媒染1min，水洗;經(jīng)95%乙醇脫色20s后水洗;蕃紅復染2min后，水洗;干燥，鏡檢。

1.4.2 生理生化特征 將拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上36℃活化培養(yǎng)48h，參照東秀珠等［10］的方法，對其培養(yǎng)物分別進行接觸酶、V-P測定、產色素、還原硝酸鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽厭氧生長、H2無機化能營養(yǎng)、水解明膠、水解淀粉、乙酰胺水解、糖產酸、醋酸鹽、己二酸鹽、庚二酸鹽、辛二酸鹽、酒石酸鹽、衣康酸鹽、異-戊酸鹽、正-戊酸鹽及糖醇類發(fā)酵實驗。

1.4.3 16S rDNA分子生物學鑒定 菌株基因組的提取:菌株基因組按照生工SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。

1.4.4 16S rDNA基因擴增序列測序及分析 將提取的基因組DNA委托生工生物工程(上海)有限公司進行16S rDNA基因擴增序列測序。測序結果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，選擇近緣10株菌的 16S rDNA 序列，用 MEGA 4.0［11］進行多重比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap測試，設置重復次數(shù)為1000次。

2 結果與分析

2.1 菌株分離、純化結果

把土壤懸液經(jīng)系列稀釋后采用涂布法接種于高氏1號平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后挑取單菌落，共分離得到32株菌，編號，將這些菌株在高氏1號斜面上培養(yǎng)，4℃保存，備用。

2.2 抗菌活性菌株的篩選結果

2.2.1 初篩結果 對分離到的32株菌開展拮抗實驗，初篩到一株對金黃色葡萄球菌具有拮抗作用的菌株A-2，見圖1。

圖1 拮抗菌A-2對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of antagonistic strain A-2 on S.aureus

2.2.2 復篩結果及抑菌譜測定 以菌株A-2的發(fā)酵液通過牛津杯法復篩，證明其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、植物乳酸桿菌和表皮葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，而對枯草芽孢桿菌和結核分歧桿菌沒有抑菌效果。由于本實驗發(fā)酵液中菌體未經(jīng)破壁處理，表明該抗菌活性物質為胞外產物。

2.2.3 抑菌最低濃度稀釋梯度的測定結果 A-2發(fā)酵液經(jīng)稀釋后，對金黃色葡萄球菌進行抑菌實驗，抑菌效果見表2。

由表2可知，發(fā)酵液稀釋到10-6濃度梯度仍對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、植物乳酸桿菌和表皮葡萄球菌具有抑菌效果，發(fā)酵液在10-7濃度梯度對各指示菌沒有抑菌效果，表明拮抗菌的抑菌最低濃度稀釋梯度為10-6，因此，該拮抗菌株有深入研究的價值，有必要對其種屬進行鑒定。

表1 拮抗菌A-2的抑菌效價Table 1 The antibacterial titer of antagonistic strain A-2

表2 各稀釋梯度發(fā)酵液的抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of the dilute fermented broth

2.3 拮抗菌株A－2的鑒定結果

2.3.1 菌株A-2的形態(tài)特征 菌株A-2的形態(tài)如圖2。

圖2 拮抗菌A-2的形態(tài)照片(10×100)Fig.2 Form photo of antagonistic strain A-2(10×100)

由圖2可知，拮抗菌株A-2的細胞形態(tài)為球狀或短桿狀，0.5～2μm ×0.5～2.6μm，菌體單一或鏈狀排列，無芽孢。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢為紅色，為革蘭氏陰性細菌。

2.3.2 A-2菌株的生理生化特征 實驗結果見表3。

綜合拮抗菌A-2的各項生理生化特征，對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應的屬、種的相關性狀，將拮抗菌A-2鑒定為產堿桿菌屬(Alcaligenes)。

2.3.3 16S rDNA分子生物學鑒定結果 A-2菌株的PCR產物電泳圖譜如圖3。由圖3電泳圖譜可知，從該菌株提取16S rDNA的PCR產物，其純度很高，只有一個條帶，根據(jù)Mark比對，其堿基對為1300bp左右。將拮抗菌 A-2的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，選擇近緣10株菌的16S rDNA序列，應用MEGA 4.0軟件進行多重比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap測試，設置重復次數(shù)為1000次。A-2的系統(tǒng)進化樹如圖4。

圖3 PCR產物電泳圖譜Fig.3 The electrophoresis pattern of PCR products

圖4 A-2系統(tǒng)進化樹Fig.4 System evolutionary tree of the strain A-2

表3 拮抗菌A-2的生理生化特征Table 3 The physiological and biochemical characters of antagonistic strain A-2

由圖4可知，金黃色葡萄球菌拮抗菌A-2與Alcaligenes sp.(HQ262549)位于同一分支，1000次bootstrap分析支持該分支;并且A-2菌株在GenBank數(shù)據(jù)庫比對中與Alcaligenes sp.(HQ262549)的相似度高達99.1%。

綜合其形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結果，將該拮抗菌株A-2鑒定為Alcaligenes sp.(HQ262549)。

3 結論與討論

微生物產生的活性物質大多為次級代謝產物，次級代謝產物形成的途徑及種類與其生存環(huán)境息息相關，由于適應環(huán)境的結果，它們形成極為特殊的生理機制，并產生特殊的代謝產物［12］。有關Alcaligenes屬菌株產生抗菌活性物質的研究已有報道，例如，沈穎從細薄星芒海綿中分離得到的一株糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)A72，其次級代謝物(環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸)對多株指標菌有抗菌活性［13］;林建朋從深海中篩選的海洋糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)WL24，其次級代謝產物(一種抗菌蛋白)對水稻紋枯病、柿子炭疽病、玉米小斑病及蔬菜灰霉病等多種植物病原真菌有較強拮抗效果［14］;Haruyama等人從(Alcaligenes faecalis SANK 74291的發(fā)酵產物中分離得到的B-1015是一種廣譜抗生素，可以抑制革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌［15］;Tokunaga等人從糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)YL-026325發(fā)酵產物中分離的Kalimantacins A、B、C對表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)有很好的抑制作用［16］?？傊?，現(xiàn)已研究報道的這些菌株均為來自海泥或海洋動物共生菌。而本研究是以甘肅中部典型干旱生境(年降雨量僅為413.94mm)土壤為分離材料，首次分離獲到了一株Alcaligenes屬細菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化及16S rDNA分子生物學方法鑒定，該拮抗菌為產堿桿菌屬菌株Alcaligenes sp.。其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、植物酸桿菌和表皮葡萄球菌均具有顯著抑菌活性，其發(fā)酵液對4株供試食品腐敗菌的抑菌最低濃度稀釋梯度均為10-6，具有開發(fā)新型微生物防腐劑的潛力。

由于其干旱、營養(yǎng)貧瘠的生活環(huán)境與海洋生境迥異，因而長期的生長適應性必然導致微生物具有獨特的生存對策及生理代謝途徑，很可能不同于海洋微生物的代謝機制，并產生獨特種類及結構的次級代謝產物。鑒于此，對于Alcaligenes sp.A-2菌株產生的次級代謝活性物質結構及其特性有待進一步深入研究。

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