陳莉?楊建云等

摘 要 目的 建立氯芐基砜衍生物（CBS）含量測定高效液相色譜法，并進(jìn)行方法學(xué)研究，驗(yàn)證方法的可靠性及科學(xué)性；方法 色譜柱為Phenomenex LUNA C18 250×4.6mm 5μm；流動(dòng)相為乙腈- 0.1%三氟乙酸（45：55，V/V）；流速1.0 mL.min-1；檢測波長279 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；結(jié)果 精密度RSD為0.6%，線性范圍為10 μg·mL-1～100 μg·mL-1 （r2=0.9990），CBS平均含量為100.91%（n=6），有關(guān)物質(zhì)與主峰分離良好。結(jié)論 該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于CBS的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 氯芐基砜衍生物 方法學(xué)研究 高效液相色譜法

輻射對正常人體細(xì)胞的損傷早在1896年就為公眾所知，其對細(xì)胞和組織的作用是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象。近年來受各種因素影響，人們受輻射幾率有所提高[1]，在一些特殊診斷、治療過程中，不可避免地會(huì)受到不同程度的輻射[2]。氯芐基砜衍生物（CBS）為一種新型的具有DNA修復(fù)功能的化合物[3]。其已被證明，在受到輻射照射時(shí)可發(fā)揮保護(hù)作用[4]。然而，目前沒有高效液相色譜法[5]可用于分析此化合物。本文旨在建立和驗(yàn)證，CBS的高效液相色譜分析；采用液相色譜分析在酸性，堿性及氧化條件下CBS的降解產(chǎn)物[6]；應(yīng)用此方法，評估CBS固態(tài)藥物穩(wěn)定性，研究其質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2996/2695高效液相色譜儀（美國）；BP211D型電子天平（德國SARTORIUS）；UV2510紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）。CBS對照品（批號(hào)20111103，純度99.96%）CBS供試品（自制，批號(hào)：20110916，20110929，20111021）均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。乙腈（色譜純）購自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；三氟乙酸（色譜純），水為純化水（哇哈哈有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18 （250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%三氟乙酸（45：55，V/V）；檢測波長：279 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣體積：20 ?L；柱溫：40 ℃。在該色譜條件下，理論板數(shù)按CBS峰計(jì)算不低于10000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 CBS色譜圖（保留時(shí)間在11.9min，雜質(zhì)峰21.3min）

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制 精密稱取對照品10 mg于100 mL量瓶中，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）溶解并制成每1 mL約含CBS0.1 mg的溶液，作為對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液配制 精密稱取樣品10 mg，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）溶解并制成每1 mL約含CBS0.05 mg的溶液，作為供試品溶液備用。

2.3 專屬性考察

2.3.1 酸降解物 取CBS樣品配制得1 mg/mL貯備液。精密量取貯備液1 mL于10 mL量瓶中，加1.0 mol.L-1鹽酸3 mL，80 ℃水浴加熱5.5小時(shí)，加1.0 mol.L-1氫氧化鈉3 mL調(diào)至中性，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，進(jìn)樣20 ?L，記錄色譜圖2（a）。

2.3.2 堿降解物 取CBS樣品配制得1 mg.mL-1貯備液。精密量取貯備液1 mL于10 ml量瓶中，加1.0 mol.L-1氫氧化鈉3 mL，80℃水浴加熱5.5小時(shí)，加1.0 mol.L-1鹽酸3 mL調(diào)至中性，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，進(jìn)樣20 ?L，記錄色譜圖2（b）。

2.3.3 氧化產(chǎn)物 取CBS樣品配制得1 mg.mL-1貯備液。精密量取貯備液1 mL于10 mL量瓶中，加30%雙氧水3 mL，80℃水浴加熱5.5小時(shí)，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，進(jìn)樣20 ?L，記錄色譜圖2（c）。

2.3.4 光降解物 取CBS樣品在4500 xl光照條件下放置10天后，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）配制得100 μg.mL-1溶液，進(jìn)樣20 ?L，記錄色譜圖2（d）。

2.4 線性范圍的考察

分別精密量取“2.2項(xiàng)下”對照品貯備液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，置10 mL量瓶，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，分別配制成10、20、40、50、60、80 μg.mL-1的梯度對照品溶液，取上述溶液及貯備液20 μL，在“2.1”色譜條件項(xiàng)下分別2次進(jìn)樣。以對照品進(jìn)樣濃度（X，μg.mL-1）為橫坐標(biāo)，以對照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明CBS在10 μg.mL-1～100 μg.mL-1的范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系?；貧w方程為Y=10018X+54521，r2=0.9990（n=7）。

2.5 檢測限與定量限的確定

以信噪比3：1時(shí)注入儀器的量為檢測限，以信噪比約為10：1時(shí)注入儀器的量為定量限。結(jié)果CBS的檢測限為1.2 ng，定量限為4.0 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下濃度為50 μg.mL-1的對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，其色譜峰面積的RSD為0.6%。結(jié)果表明測定時(shí)儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批的LF原料藥按“2.2”項(xiàng)下方法制備濃度為40 μg.mL-1、50 μg.mL-1和60 μg.mL-1的高中低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行配制3份，共9份，在“2.1”色譜條件項(xiàng)下分別進(jìn)樣測定，平均含量為100.91%，RSD為0.93%，表明本法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取室溫下放置的高、中、低3個(gè)濃度的供試品溶液，在0，4，8，12，24，48，72 h分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計(jì)算高、中、低3個(gè)濃度的峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%及0.43%。表明供試品溶液在室溫放置72h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 有關(guān)物質(zhì)

取樣品10 mg，加不加酸流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL約含0.1 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，精密量取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使對照溶液中主成分峰的峰高約為記錄儀滿量程的10%-30%；再取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍，供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰，用各有關(guān)物質(zhì)峰面積與對照溶液主成分峰面積（1%）做比較，計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量，單個(gè)雜質(zhì)不得大于1.0%，總雜質(zhì)不得高于1.5%，結(jié)果見表1。

3 含量測定

精密量取供試品儲(chǔ)備液5 mL置10 mL量瓶中，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，搖勻，得到50 μg.mL-1的樣品溶液。精密量取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。另取對照品儲(chǔ)備液5 mL置10 mL量瓶中，加不加酸流動(dòng)相（乙腈：水=45：55）稀釋至刻度，搖勻，得到50 μg.mL-1的對照品溶液，依“2.1項(xiàng)下”色譜條件測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算其含量，結(jié)果見表1。

4 討論

4.1 波長選擇

采用全波長對樣品進(jìn)行測定，通過考察各成分的分離情況及各色譜峰的豐度，最后選定檢測波長為279 nm。

4.2 流動(dòng)相確定

比較3種流動(dòng)相系統(tǒng)及其不同的流動(dòng)相比例，包括乙腈：0.1%三氟乙酸、甲醇：0.1%三氟乙酸、乙腈：醋酸水溶液，比較的醋酸濃度有0.1%，0.05%醋酸水溶液；乙腈：0.1%三氟乙酸系統(tǒng)考察等度及梯度系統(tǒng)。結(jié)果表明，各種流動(dòng)相中以乙腈：0.1%三氟乙酸系統(tǒng)最佳，其圖譜上各個(gè)色譜峰的分離度較好，保留時(shí)間適中，因此選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)作為樣品HPLC檢測的流動(dòng)相。

4.3 色譜柱考察

選擇不同填料、規(guī)格及廠家的色譜柱進(jìn)行比較，包括Phenomenex LUNA C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）。結(jié)果表明，各種色譜柱中以Phenomenex LUNA C18 Colum最佳，所得色譜圖分離度良好，柱效較高，因此選擇此色譜柱作為樣品HPLC檢測色譜柱。按本文的色譜條件對樣品進(jìn)行測定，樣品均能與其他成分很好的分離，測得理論板數(shù)、分離度及對稱因子，結(jié)果見表2。

4.4 其他

比較不同柱溫與流速，柱溫升高，分析時(shí)間縮短，峰型改善；流速低于1.0 ml.min-1分析時(shí)間延長，高于1.0 ml.min-1分析時(shí)間縮短。因此選擇柱溫40 ℃與流速1.0 ml.min-1。

綜上所述，經(jīng)過試驗(yàn)確定了CBS的HPLC分析方法，同時(shí)測定了3批次該原料藥。上述方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，操作簡單易于實(shí)施，可用于CBS的質(zhì)量控制。

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