張 萍, 何國(guó)祥, 劉建平

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過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ激動(dòng)劑對(duì)直流電刺激后兔缺血心肌組織中PTEN蛋白表達(dá)及左室重構(gòu)的影響

張 萍, 何國(guó)祥*, 劉建平

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院心內(nèi)科, 重慶 400038）

探討染色體10缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因（PTEN）在兔急性心肌梗死（MI）邊緣區(qū)心肌組織中的表達(dá)及其意義以及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ激動(dòng)劑（羅格列酮）對(duì)其表達(dá)的影響。50只日本大耳白兔，隨機(jī)分為假手術(shù)組（SH組，＝5）、MI組＝15、常規(guī)電刺激組（EFs組，＝15）和羅格列酮干預(yù)電刺激組（R-EFs組，＝15）。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立急性MI或SH組模型后，在結(jié)扎血管兩側(cè)心外膜上縫合固定一對(duì)鉑金電極，直流電刺激（電場(chǎng)強(qiáng)度4.0V/cm，30min/d），羅格列酮以4mg/（kg·d）灌胃。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)以Western印跡法檢測(cè)各組1周、2周及4周時(shí)心肌組織中PTEN表達(dá)并測(cè)定左、右心室重量和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。正常心肌組織和缺血心肌組織均有一定程度PTEN表達(dá)，EFs組心肌組織中PTEN表達(dá)較MI組升高（0.01），羅格列酮干預(yù)使缺血心肌組織中PTEN表達(dá)較EFs組進(jìn)一步升高（0.05），同時(shí)左室收縮功能較EFs組進(jìn)一步改善。PPARγ激動(dòng)劑可進(jìn)一步促進(jìn)缺血心肌組織在直流電刺激后PTEN的表達(dá)，從而使左心室功能得到改善。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ激動(dòng)劑; PTEN; 直流電場(chǎng); 心肌梗死; 左心室功能

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferater activated receptor γ，PPARγ）是一類(lèi)與甲狀腺激素和維甲酸受體密切相關(guān)的核激素受體，羅格列酮為PPARγ合成配體，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可激活PPARγ，促進(jìn)人類(lèi)正常細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及癌細(xì)胞的染色體10缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）的表達(dá)[1]，但羅格列酮干預(yù)對(duì)缺血心肌組織中PTEN蛋白表達(dá)的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究目的在于觀察低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)刺激后缺血心肌組織PTEN表達(dá)的變化以及羅格列酮干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康的日本大耳白兔50只，三月齡，雌雄不拘，體質(zhì)量2.0～2.6kg，隨機(jī)分為假手術(shù)組（SH組）、心肌梗死（myocardial infarction，MI）組、常規(guī)電刺激組（EFs組，場(chǎng)強(qiáng)4.0V/cm）以及羅格列酮干預(yù)電刺激組（R-EFs組，場(chǎng)強(qiáng)4.0V/cm），分別觀察術(shù)后1、2和4周，每組5只兔。EFs組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending branch，LAD）建立急性MI模型并安置電極，術(shù)后第二天開(kāi)始施加4.0V/cm電刺激，30min/d。MI組僅建立急性MI模型并安置電極，但無(wú)電刺激治療。SH組安置電極，LAD僅穿線不結(jié)扎。R-EFs組建模方式及電刺激方式同電治療組，從術(shù)后第二天開(kāi)始，電治療同時(shí)給予羅格列酮片4mg/kg溶解于生理鹽水灌胃，1次/d[2]。所有動(dòng)物購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)依照第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)頒布的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行。

1.2 主要試劑、材料和儀器

鼠抗兔PTEN多克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling公司）；羅格列酮片（4mg/片，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司）；電極為自制的鉑金電極，電極頭長(zhǎng)15.0mm、寬1.1mm、厚0.5mm，與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）導(dǎo)絲焊接，從焊接處套上橡膠絕緣管，構(gòu)成電極絕緣部分共20cm長(zhǎng)；RM6280多導(dǎo)生理記錄儀（四川成都儀器廠）；WYJ系列高精度直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源（上海山杰科技有限公司）；Western印記法凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建及標(biāo)本收集

3%戊巴比妥鈉鹽按1ml/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉生效后，剪開(kāi)心包后在LAD左心耳起源與心尖連線的中點(diǎn)處以0號(hào)絲線縫扎血管，以心電圖相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高，兔左室前壁與心尖部心肌由紅潤(rùn)變青紫，確定急性MI模型建立。在急性MI模型成功建立后立即在LAD兩側(cè)的心外膜上縫合固定一對(duì)鉑金屬電極，兩電極之間相距1cm。不縫合心包關(guān)閉胸腔，然后通過(guò)皮下隧道將陰、陽(yáng)兩條電極固定于兔的頸背部。術(shù)后青霉素鈉鹽22000u/（kg·d），連續(xù)3d肌注。術(shù)后電刺激治療過(guò)程中以RM6280多導(dǎo)生理記錄儀監(jiān)測(cè)心律失常發(fā)生情況。

1.4 測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及留取心肌組織標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將各組實(shí)驗(yàn)兔以3%戊巴比妥鈉鹽按1ml/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉，右頸動(dòng)脈插管至左心室，應(yīng)用RM6280型8道生理記錄儀記錄主動(dòng)脈、左心室壓力曲線。測(cè)量心率（heart rate，HR）、平均動(dòng)脈壓（mean artery pressure，MAP）、左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）及±dp/dtmax。完成壓力曲線記錄后立即開(kāi)胸取出心臟，肝素鹽水沖洗，棉紙吸干水分后分別稱(chēng)量左心室（包括室間隔）和右心室濕重。計(jì)算左心室濕重（left ventricular weight，LVW）/體質(zhì)量（body mass，BS）和右心室濕重（right ventricular weight，RVW）/BS，分別為左心室心肌肥厚指數(shù)和右心室心肌肥厚指數(shù)。留取左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織100mg迅速放入液氮凍存。

1.5 Western印記法測(cè)定缺血心肌組織中PTEN的表達(dá)

提取心肌組織中的總蛋白，蛋白質(zhì)定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品濃度，灌制10% SDS-PAGE，上樣量為30μg，Bio-Rad公司Mini系電泳槽進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入一抗、二抗后用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描成像，并用Quantity One 4.4.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)量以“目的蛋白的光密度（）值與GAPDH的值的比值”表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兔一般情況

本實(shí)驗(yàn)中的兔50只，共死亡4只。MI組死亡2只，其中一只尸檢提示大量心包積液，另一只術(shù)后進(jìn)食差，衰竭死亡；EFs組死亡1只，尸檢提示心包粘連；R-EFs組死亡1只，尸檢未發(fā)現(xiàn)明顯異常，其余兔均存活至各自的觀察終點(diǎn)，總死亡率8.0%。

2.2 兔心室重構(gòu)以及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的改變

MI4周組LVW/BS大于SH組，EFs4周及R-EFs4周組LVW/BS均小于MI4周組（均為＜0.05），R-EFs4周組LVW/BS較EFs4周更?。ǎ?.05）。與SH組比較MI4周組LVEDP明顯增高，LVSP和+dp/dtmax顯著降低（＜0.05）。EFs4周組LVEDP、LVSP、MAP以及±dp/dtmax與MI4周組比較均有改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。R-EFs4周組LVEDP較EFs4周組降低，同時(shí)LVSP、MAP以及±dp/dtmax升高（＞0.05，表1）。

2.3 缺血心肌組織中PTEN表達(dá)的變化

Western印記法結(jié)果顯示，各組的PTEN表達(dá)程度不同。MI組梗死邊緣區(qū)心肌組織中PTEN蛋白表達(dá)較EFs組低。外加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)干預(yù)后，缺血心肌組織PTEN表達(dá)逐漸升高，至第1周后顯著高于MI組（＜0.01，圖1）。

給予兔羅格列酮治療后，R-EFs組MI邊緣區(qū)心肌組織中PTEN蛋白表達(dá)隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而較EFs組逐漸增加。治療后第1周 R-EFs組PTEN表達(dá)較同時(shí)點(diǎn)EFs組升高（＜0.05），2周后R-EFs組PTEN表達(dá)不再繼續(xù)明顯升高，但仍較同時(shí)點(diǎn)EFs組升高（＞0.05）。

3 討 論

研究顯示，組織損傷后，傷口及其附近上皮存在的損傷電流可形成內(nèi)源性電場(chǎng)，這種內(nèi)源性電場(chǎng)是穩(wěn)恒直流電場(chǎng)，具有促進(jìn)損傷愈合等生物學(xué)效應(yīng)，外加直流電場(chǎng)可增強(qiáng)內(nèi)源性電場(chǎng)的這種作用[3]。本課題組早期研究顯示電刺激促進(jìn)兔損傷心肌修復(fù)并改善心室功能，Uemura等[4]亦發(fā)現(xiàn)電刺激迷走神經(jīng)可使心肌細(xì)胞中活化的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）表達(dá)降低，從而減少心室肥厚。因此，我們對(duì)MI后兔進(jìn)行電刺激，以了解其對(duì)心臟保護(hù)的作用及其可能的機(jī)制。

PTEN基因是1997年由Li等分離得到的一種抑癌基因。隨著胚胎進(jìn)一步發(fā)展，PTEN在不同組織中表達(dá)有所不同[5]。PTEN對(duì)其下游的信號(hào)傳導(dǎo)3、4、5-三磷酸酯酰肌醇/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）途徑起負(fù)調(diào)節(jié)作用，可阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路所介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、分化和凋亡[6]。PTEN所具有的抑制腫瘤血管生成的作用，使其在腫瘤的治療中備受關(guān)注，已成為研究的熱點(diǎn)。但對(duì)于缺血心肌組織中PTEN表達(dá)的情況目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

表1 兔心室重構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變

注: SH: 假手術(shù)組; MI: 心肌梗死組; EFs: 常規(guī)電刺激組; R-EFs: 羅格列酮干預(yù)電刺激組; LVS/BS: 左心室濕重/體質(zhì)量; RVW/BS: 右心室濕重/體重量; LVSP: 左室收縮壓; LVEDP: 做事舒張末壓; HR: 心率; MAP: 平均動(dòng)脈壓。與同時(shí)相點(diǎn)MI組比較,P＜0.05; 與SH組比較,#＜0.05

圖1 Western印記法檢測(cè)各治療組PTEN蛋白的表達(dá)

Figure 1 Expressions of PTEN protein in different groups with Western-blot

SH: 假手術(shù)組; MI4周: 心肌梗死4周組; EFs: 常規(guī)電刺激組；R-EFs: 羅格列酮干預(yù)電刺激組(從1～3依次為外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激治療后第1, 2和4周）

本研究發(fā)現(xiàn)，正常和缺血心肌組織中均有一定程度的PTEN的表達(dá)。在MI邊緣區(qū)心肌組織中，EFs組、R-EFs組以及MI組的PTEN表達(dá)程度不同。MI組梗死邊緣區(qū)心肌組織中PTEN蛋白表達(dá)較EFs組低。外加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)干預(yù)后PTEN表達(dá)逐漸升高，至第1周后顯著高于MI組（＜0.01），但術(shù)后2周后EFs組PTEN表達(dá)未再繼續(xù)顯著增加。

PTEN與心臟病有著密切的關(guān)系，特異性 PTEN 基因敲除的小鼠出現(xiàn)心臟收縮功能的下降[7]。本課題組早期實(shí)驗(yàn)提示直流電刺激后缺血心肌組織中Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維生成較MI組減少，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)直流電刺激抑制平滑肌細(xì)胞增生從而抑制球囊損傷后兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的增生，這一作用通過(guò)PTEN/PI3K/Akt/P27kip1通路實(shí)現(xiàn)[8]。由于PTEN抑制成纖維細(xì)胞、膠原纖維以及平滑肌細(xì)胞增殖，因此PTEN表達(dá)增加可抑制心肌肥大及纖維化，從而改善心臟功能。在本實(shí)驗(yàn)中，EFs4周組的左室功能較MI4周組提高，同時(shí)左心室肥厚指數(shù)降低，證實(shí)外加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)通過(guò)使PTEN表達(dá)增加，從而減輕MI后的左心室重構(gòu)，改善左心功能。

PTEN啟動(dòng)子上游10kb處有兩個(gè)PPARγ的結(jié)合位點(diǎn)[2]，作為PPARγ激動(dòng)劑，羅格列酮可激活PPARγ并通過(guò)與這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)人類(lèi)正常細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)[1]。然而，對(duì)于羅格列酮是否能影響缺血心肌組織中PTEN的表達(dá)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。我們研究了羅格列酮對(duì)PTEN表達(dá)的影響及其意義。結(jié)果顯示，給予羅格列酮干預(yù)后，直流電刺激組MI邊緣區(qū)心肌組織中PTEN的表達(dá)較羅格列酮干預(yù)前顯著增加，說(shuō)明羅格列酮能進(jìn)一步促進(jìn)缺血心肌組織中PTEN的表達(dá)。同時(shí)，羅格列酮干預(yù)后兔左室功能較未用羅格列酮的常規(guī)電刺激組進(jìn)一步改善，雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍證明羅格列酮進(jìn)一步抑制心室重構(gòu)、改善心功能的作用。

本研究結(jié)果顯示直流電刺激后缺血心肌組織PTEN的表達(dá)增加，MI后心室重構(gòu)改善。羅格列酮能進(jìn)一步促進(jìn)電刺激后的PTEN表達(dá)，更有利于MI后左室功能的恢復(fù)。但PTEN信號(hào)通路在改善心室重構(gòu)中是否發(fā)揮主要作用，兩者之間的相關(guān)性如何，尚有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] 董少紅, 李 鵬, 曾春苗, 等. 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ激動(dòng)劑對(duì)球囊損傷血管平滑肌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(22): 4218-4222.

[2] Wu W, Celestino J, Milam MR,. Primary chemoprevention of endometrial hyperplasia with the peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist rosiglitazone in the PTEN heterozygote murine model [J]. Int J Gynecol Cancer, 2008, 18(2): 329-338.

[3] Saunders RD, McCaig CD. Developmental effects of physiologically weak electric fields and heat: an overview[J]. Bioelectromagnetics, 2005, Suppl 7:S127-132.

[4] Uemura K, Li M, Tsutsumi T,. Efferent vagal nerve stimulation induces tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbit[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 293(4): H2254-2261.

[5] Gimm O, Attie-Bitach T, Lees JA,. Expression of the PTEN tumour suppressor protein during human development[J]. Hum Mol Genet, 2000; 9(11): 1633-1639.

[6] Oudit GY, Penninger JM. Cardiac regulation by phosphoinositide 3-kinases and PTEN[J]. Cardiovasc Res, 2009, 82(2): 250-260.

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[8] Zhang P, Liu Z, He G,. Electrical stimulation inhibits neointimal hyperplasia after abdominal aorta balloon injury through the PTEN/p27Kip1 pathway[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2010, 42(11): 807-815.

（編輯: 胡曉暉）

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist promotes PTEN expression and left ventricular remodeling in rabbit ischemia myocardium

ZhANG Ping, HE Guoxiang*, LIU Jianping

(Department of Cardiology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

To determine the expression and significance of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN) in the marginal area of myocardial infarction, and the effect of peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist (PPAR-γ), rosiglitazone, on the expression in acute myocardial infarction (MI) rabbit model after the direct current (DC) electric fields (EFs) stimulation.Fifty rabbits were randomly divided into sham-operation group (SH group,＝5), MI group (＝15), DCEFs treatment group (EFs group,＝15), and DCEFs+rosiglitazone treatment group (R-EFs group, rosiglitazone 4 mg/kg·d,). After the corresponding model was established by occluding left anterior descending branch in the later 3 groups, DCEFs stimulation (4.0V/cm, 30min/d) was given to the later 2 groups for 1, 2 and 4 weeks respectively (＝5 for each time point). The expression of PTEN in the ischemia myocardium was detected by Western blotting. Meanwhile, the ratio of left or right ventricular weight/body mass (LVW/BS or RVW/BS) and the hemodynamic indexes were measured.There was some expression of PTEN in cardiac tissue of SH group and MI group. The expression of PTEN in EFs group was higher than in MI group(＜0.01), and the expression in R-EFs group was higher than EFs group(＜0.05). In the meantime, compared to MI group, left ventricular function was improved in EFs group and R-EFs group.PPARγ promotes the expression of PTEN and thus further improves the left ventricular systolic function.

peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist; PTEN; direct current electric fields; myocardial infarction; left ventricular systolic function

(No.81170142)

R363

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00056

2012-12-10;

2013-02-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81170142）

張萍, 現(xiàn)在貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科工作

何國(guó)祥, Tel: 023-68754268, E-mail: yyxnk@yahoo.com.cn