李博 施景龍 邱厚匡 許鳴

【關(guān)鍵詞】過氧化物酶體增殖物激活受體-γ;胰腺癌;細(xì)胞增殖

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度高、預(yù)后差的惡性腫瘤之一，由于其侵襲性強(qiáng)，早期往往已經(jīng)浸潤大血管、神經(jīng)等，造成手術(shù)切除難度大，嚴(yán)重降低生存率，5年總體生存率不足1%[1]。過氧化物酶體增殖物-γ（PPAR-γ）除參與脂肪代謝、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞周期的調(diào)控等細(xì)胞功能調(diào)節(jié)外，還與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切[2]。筆者前期試驗(yàn)表明促進(jìn)PPAR-γ表達(dá)可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及侵襲性[3]。本實(shí)驗(yàn)擬明確調(diào)控PPAR-γ表達(dá)對(duì)BxPc-3細(xì)胞增殖活性的影響。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌BxPc-3細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞研究所;PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮購自美國Sigma;胰酶、高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）試劑盒購自中國碧云天公司;鼠抗人PPAR-γ抗體及GAPDH內(nèi)參購自南京凱基公司。

二、方法

1.細(xì)胞株與培養(yǎng)

人胰腺癌BxPc-3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞均呈貼壁生長。每2～3d用0.25%胰酶消化傳代1次。根據(jù)前期研究經(jīng)驗(yàn)，將BxPc-3細(xì)胞分5組處理96h，分別為不加藥物的對(duì)照組（對(duì)照組）、加入終濃度5μmol/L羅格列酮組（5μmol/L羅格列酮組）、加入終濃度10μmol/L羅格列酮組（10μmol/L羅格列酮組）、加入終濃度20μmol/L羅格列酮組（20μmol/L羅格列酮組）、加入終濃度40μmol/L羅格列酮組（40μmol/L羅格列酮組）。

2.PPAR-γ表達(dá)水平的檢測

采用蛋白免疫印跡法：收集對(duì)數(shù)生長期BxPc-3細(xì)胞，各組BxPc-3細(xì)胞加藥后加入600μlRIPA細(xì)胞裂解液，離心30min，收集上清液即總蛋白，加2倍體積十二烷基酸鈉上樣緩沖液，電泳后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗（PPAR-γ抗體，1∶100），4℃孵育過夜，洗膜3次，加入羊抗鼠二抗（1∶10000），37℃孵育2h，電化學(xué)發(fā)光（ECL）法檢測，感光顯影。AlphaImager2200圖像系統(tǒng)分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)4個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

3.BxPc-3細(xì)胞增殖活性的檢測

3.BxPc-3細(xì)胞增殖活性的檢測采用MTT法檢測：收集對(duì)數(shù)生長期的BxPc-3細(xì)胞，各組BxPc-3細(xì)胞加藥處理后加入20μlMTT溶液，孵育4h，再加入150μl二甲基亞砜（DMSO）震蕩10min，使用ELISA檢測儀于490nm波長處測量各組吸光度值（增殖活性）。每組設(shè)4個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS16.0處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同濃度羅格列酮對(duì)BxPc-3細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)水平的影響

5組BxPc-3細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.922，P<0.001）。5μmol/L羅格列酮組、10μmol/L羅格列酮組BxPc-3細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），但20μmol/L羅格列酮組、40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)水平升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），且40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)水平高于5μmol/L羅格列酮組、10μmol/L羅格列酮組和20μmol/L羅格列酮組（P均<0.05），見圖1。

二、不同濃度羅格列酮對(duì)BxPc-3細(xì)胞增殖活性的影響

MTT檢測顯示，5組BxPc-3細(xì)胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.966，P<0.001）。5μmol/L羅格列酮組、10μmol/L羅格列酮處理后BxPc-3細(xì)胞增殖活性分別為0.60±0.07、0.57±0.06，與對(duì)照組的0.62±0.09比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）;40μmol/L羅格列酮組細(xì)胞增殖活性為0.30±0.02，低于20μmol/L羅格列酮組的0.45±0.03，且2組BxPc-3細(xì)胞增殖活性均低于對(duì)照組、5μmol/L羅格列酮組和10μmol/L羅格列酮組（P均<0.05），見圖2。

討論

PPAR是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，有α、β和γ這3種亞型，3種亞型在功能和結(jié)構(gòu)有一定差異[4]。PPAR-γ配體分為外源性和內(nèi)源性2大類，其中外源性配體以胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物為代表，包括羅格列酮、吡格列酮等，臨床用于治療胰島素抵抗、糖尿病等，內(nèi)源性配體則包括一些不飽和脂肪酸及其代謝產(chǎn)物，如花生四烯酸、亞油酸等，還有前列腺素衍生物、前列腺素D2等，這些天然激動(dòng)劑活性都較低[5-6]。

PPAR-γ最初發(fā)現(xiàn)是與胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞分化和器官纖維化等有關(guān)。近年研究顯示其與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。已有報(bào)道PPAR-γ在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌、食管癌和淋巴瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)[7]。Tsujie等（2003年）報(bào)道PPAR-γ在包括BxPc-3細(xì)胞在內(nèi)的6種胰腺癌細(xì)胞株上表達(dá)。Kristiansen等（2006年）在129例胰腺癌患者的癌組織中檢測PPAR-γ，71.3%的病例中有PPAR-γ的表達(dá)，且其表達(dá)與胰腺癌的分級(jí)和分期呈正相關(guān)，推測PPAR-γ與胰腺癌有關(guān)。PPAR-γ在胰腺癌中的確切作用機(jī)制尚未闡明。Eibl等（2001年）認(rèn)為，PPAR-γ可能通過誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而阻止胰腺癌細(xì)胞生長。

筆者前期研究使用羅格列酮促進(jìn)BxPc-3細(xì)胞中PPAR-γ表達(dá)，結(jié)果顯示羅格列酮可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3細(xì)胞EMT及侵襲性。本實(shí)驗(yàn)中筆者繼續(xù)將不同濃度羅格列酮作用于BxPc-3細(xì)胞，結(jié)果顯示20、40μmol/L羅格列酮可以有效促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)，且40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細(xì)胞的PPAR-γ表達(dá)高于20μmol/L羅格列酮組。MTT結(jié)果提示20μmol/L羅格列酮組、40μmol/L羅格列酮組BxPc-3細(xì)胞增殖活性明顯下降，表明PPAR-γ表達(dá)可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3細(xì)胞增殖活性。

綜上所述，本研究結(jié)果初步揭示了PPAR-γ激動(dòng)劑的抗胰腺癌細(xì)胞增殖特性，而探索PPAR-γ參與人胰腺癌BxPc-3細(xì)胞增殖及EMT的信號(hào)傳導(dǎo)通路將是我們下一步的研究方向。