景 濤, 劉建平, 苗 莉, 馮 健, 冉擘力, 王海東, 何國祥*

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AT2R基因在體可調(diào)控表達對大鼠血管損傷后MMP-2表達的影響

景 濤1, 劉建平1, 苗 莉1, 馮 健2, 冉擘力1, 王海東3, 何國祥1*

（第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院:1心內(nèi)科,3胸心外科, 重慶 400038;2瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 瀘州 646000）

研究間充質(zhì)干細胞（MSCs）移植實現(xiàn)血管緊張素Ⅱ2型受體（AT2R）基因在體可調(diào)控表達對大鼠頸動脈損傷后新生內(nèi)膜中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）表達的影響。采用常規(guī)分子生物學方法連續(xù)兩個回合轉染體外培養(yǎng)的MSCs，獲得受到強力霉素（Dox）調(diào)控的低背景、高誘導表達AT2R基因的雙重穩(wěn)定MSCs系；建立大鼠頸動脈球囊損傷動物模型，將雙重穩(wěn)定MSCs系種植于動脈損傷局部，通過尾靜脈注射Dox，分別于術后14、28d行病理切片，采用免疫印跡、免疫組化法及RT-PCR等技術檢測AT2R基因在新生內(nèi)膜中的表達及其對MMP-2表達的影響。成功建立了低背景、高誘導表達AT2R基因的雙重穩(wěn)定MSCs系。該MSCs系受到Dox給予/去除的緊密調(diào)控，誘導后48h即可使AT2R顯著表達，在Dox干預72h后AT2R表達進一步增強；這種表達的可誘導性至少在8周內(nèi)維持穩(wěn)定。免疫印跡、免疫組化及RT-PCR檢測顯示：球囊損傷大鼠血管后14d及28d，Dox組新生內(nèi)膜中AT2R的表達顯著高于對照組、MSC組、MSC轉染組（＜0.01）；同時，Dox組新生內(nèi)膜中MMP-2陽性染色較對照組、MSC組和MSC轉染組顯著減弱（＜0.01）。血管損傷局部導入雙重穩(wěn)定MSCs系后AT2R表達受到Dox的良好調(diào)控。Dox誘導AT2R表達后，新生內(nèi)膜中MMP-2表達減少，可能是MSCs細胞移植實現(xiàn)AT2R基因在體可調(diào)控表達有效抑制新生內(nèi)膜增生的機制之一。

血管緊張素Ⅱ2型受體; 可調(diào)控表達; 間充質(zhì)干細胞; 新生內(nèi)膜增生; 基質(zhì)金屬蛋白酶

血管內(nèi)皮損傷后中層血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的遷移、過度增殖及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增加是血管成形術后再狹窄發(fā)生的基本病理生理基礎，因此，有效抑制VSMCs的遷移、增殖及ECM增加是預防再狹窄發(fā)生的研究焦點[1]。有研究顯示[2-4]，血管損傷后，骨髓中的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）黏附于損傷的血管局部，并進一步分化為VSMCs和內(nèi)皮細胞，這些骨髓前體細胞來源的VSMCs與血管中膜遷移而來的VSMCs一起，共同參與血管損傷后再狹窄的形成。同時，近來研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ的2型受體（AT2R）對細胞的增殖、遷移具有負性影響，通過局部導入使其表達增強可以明顯減輕新生內(nèi)膜的面積[5]。因此，PCI術后，促使損傷血管局部表達AT2R增高并發(fā)揮功能活性，將為再狹窄的防治開辟新途徑。

VSMCs遷移時，一方面分泌大量ECM，一方面又產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）使ECM不斷降解，因此血管再狹窄的過程也是基質(zhì)重建的過程[6]。本實驗室的前期系列研究結果表明[7]，體外培養(yǎng)的雙重穩(wěn)定表達AT2R基因的VSMCs在Dox的干預下，AT2R基因表達增高的同時，抑制了VSMCs的增生，而且ECM成分發(fā)生了相應地變化，推測AT2R基因可能通過對ECM形成的影響，減輕血管損傷后新生內(nèi)膜形成過程中的結構重塑，減低再狹窄的發(fā)生。那么在體情況下，導入轉染了外源可調(diào)控AT2R基因的MSCs對血管中新生內(nèi)膜形成及ECM的影響，尚缺乏有關的研究。因此，本實驗觀測轉染了外源可調(diào)控AT2R基因的MSCs導入后在Dox干預下，MMP-2表達在轉錄和翻譯水平受到的影響，進一步完善我們實驗室對AT2R在體可調(diào)控表達的研究。

1 材料與方法

1.1 大鼠MSCs的分離及培養(yǎng)

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量80～100g，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。3%戊巴比妥過量麻醉處死后，無菌條件下分離雙側股骨及脛骨，剪去骨端，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無血清DMED培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，全骨髓離心（1000r/min，10min），將全骨髓離心沉淀物加入淋巴細胞分離液后離心（1500r/min，20min），小心吸取中間單個核細胞層界面，加入DMEM全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2 建立Dox-on雙重穩(wěn)定表達AT2R基因MSCs細胞系[7]

1.2.1 大鼠AT2R基因Dox誘導表達系統(tǒng)的構建 采用同源重組方法將AT2R目的基因片段克隆于含TetO重復序列的表達載體pUHD10-3中，從而建立由調(diào)控質(zhì)粒pUHD 17-1hyg、哺乳動物表達質(zhì)粒pUHD 10-3/AT2R、熒光報告質(zhì)粒pUHC 13-3以及提供新霉素篩選抗性的簡單質(zhì)粒pSV2neo四種成分組成的受Dox調(diào)控的哺乳動物表達系統(tǒng)（Dox-on系統(tǒng)）。

1.2.2 脂質(zhì)體轉染 按照脂質(zhì)體轉染試劑盒的說明，連續(xù)兩個回合轉染MSCs，通過抗生素壓力篩選出抗性克隆。采用熒光素酶表達瞬時轉染法檢測不同細胞克隆熒光素酶活性改變（相對熒光單位s-1，RLU s-1）；應用RT-PCR法分別檢測Dox給予前后AT2R mRNA的表達情況，根據(jù)各個細胞克隆受Dox調(diào)控表達的程度，篩選出低背景、高誘導表達AT2R目的基因克隆作為雙重穩(wěn)定MSCs細胞系并進行擴增培養(yǎng)。

1.2.3 Dox-on雙重穩(wěn)定MSCs細胞系AT2R蛋白表達檢測 實驗分對照組（未轉染組）、轉染后1周未經(jīng)Dox干預組、轉染后經(jīng)Dox 1mg/L干預48h組、干預72h組，同時觀測至轉染后8周。應用Western blotting檢測Dox誘導下AT2R蛋白表達情況。一抗為兔抗人AT2R多克隆抗體（1∶500，美國Santa Cruz公司），凝膠掃描成像系統(tǒng)進行分析，蛋白表達量用與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值表示。

1.3 大鼠頸動脈球囊損傷模型的建立及MSCs移植

實驗分5組：正常組（未進行球囊擴張）、對照組（球囊擴張后未導入MSCs組）、MSC組（球囊擴張后導入未轉染AT2R的常規(guī)培養(yǎng)MSCs）、MSC轉染組（球囊擴張后導入轉染AT2R的MSCs，未給予Dox）、Dox組（球囊擴張后導入轉染AT2R的MSCs，并給予Dox）。取雄性SD大鼠（體質(zhì)量380～450g），巴比妥鈉麻醉后夾閉左頸總動脈近心端及頸內(nèi)動脈，結扎頸外動脈遠端；向球囊損傷的左頸總動脈節(jié)段內(nèi)注入MSCs懸液50μl（1×104/ml），對照組注入PBS。留置30min后，結扎頸外動脈，恢復頸總動脈至頸內(nèi)動脈血流。Dox組于手術后當天開始至處死前一天每天尾靜脈注射Dox（100μg/kg）。分別于術后14、28d（各時相點每組12只大鼠）分離頸總動脈，取損傷血管段及對側正常血管段保存待檢。

1.4 各組血管AT2R的表達檢測

采用兔抗人AT2R多克隆抗體（1∶100，美國Santa Cruz公司）免疫印跡及免疫熒光檢測AT2R的蛋白在血管表達。Image pro plus6.0圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

1.5 新生內(nèi)膜增生的檢測

各組血管HE染色，在光鏡下觀察血管內(nèi)膜增生情況，以內(nèi)彈力膜為界限區(qū)分內(nèi)膜和中膜，利用Image pro plus6.0計算機圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜面積和中膜面積，并計算內(nèi)膜/中膜面積比（I/M）。

1.6 新生內(nèi)膜中MMP-2表達檢測

RT-PCR方法檢測血管中MMP-2 mRNA的表達：MMP-2引物（307bp），退火溫度55℃，正義 5-TCA ACG GTC GGG AAT ACA-3；反義5￠-CCC ACA GTG GAC ATA GCG-3￠。GAPDH引物（452 bp），正義：5￠-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3￠，反義：5￠-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3￠。PCR擴增產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠常規(guī)電泳，結果行凝膠掃描留存，并行圖像分析，mRNA表達量用Intensity（INT）表示。免疫組化法方法同上。其中鼠抗MMP-2單克隆抗體（為1∶100稀釋）美國LAB VISION公司。Image pro plus6.0圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 雙重穩(wěn)定MSCs細胞系中AT2R蛋白表達

免疫印跡法檢測結果表明，未轉染對照組無AT2R蛋白的表達，轉染組中未經(jīng)Dox干預的細胞未見到明顯的AT2R蛋白表達，轉染后經(jīng)Dox（1mg/L）干預48h后可見AT2R蛋白被顯著誘導表達；這種表達在Dox干預后72h進一步增強（圖1）；并且這種表達的可誘導性至少在8周內(nèi)維持穩(wěn)定（資料未顯示）。

2.2 損傷血管段細胞移植后AT2R的表達情況分析

實驗動物數(shù)量分析實驗選用SD大鼠120只（每組12只），無脫失，均進入結果分析。免疫組織化學結果顯示，未行球囊內(nèi)皮剝脫的右頸總動脈未見AT2R蛋白表達，在損傷后14d時，對照組在動脈壁的內(nèi)膜、中膜及外膜有少量AT2R表達（OD值：47.62±12.11），MSC組（52.22±9.08）、MSC轉染組（50.76±10.42）及對照組3組間比較，AT2R的表達差異無統(tǒng)計學意義（＝1.149，＞0.05），而Dox組新生內(nèi)膜中AT2R的表達顯著高于其他手術組（88.20±21.39，＝51.277，＜0.01）；損傷后28d時各組血管壁中AT2R的表達較14d時均有所降低（OD值分別為37.12±9.50、38.78±5.76、41.50±9.98），Dox組AT2R蛋白表達（85.67±19.88）仍顯著高于其它手術組（＜0.01）。

圖1 雙重穩(wěn)定表達AT2R基因MSCs細胞系中AT2R蛋白表達

Figure 1 AT2R protein expression in double-stable MSCs lines (＝10)

A: 未轉染組; B: 轉染后1周未經(jīng)Dox干預組; C: 轉染后1周經(jīng)Dox 1mg/L干預48h組; D: 轉染后1周經(jīng)Dox 1mg/L干預72h組。與轉染后1周未經(jīng)Dox干預組比較,P＜0.05; 與轉染后1周經(jīng)Dox 1mg/L干預48h組比較,#＜0.05

2.3 雙重穩(wěn)定表達AT2R基因MSCs移植對血管損傷局部MMP-2mRNA表達的影響

實驗結果顯示，在正常組血管壁中，存在很弱的MMP-2 mRNA基礎表達，在球囊損傷后14d時，對照組、MSC組和MSC轉染組的MMP-2 mRNA表達量顯著增加，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01），3組間MMP-2m RNA表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（＝1.319，＞0.05）；Dox組MMP-2m RNA表達量亦較正常組增加（＜0.01），但表達水平顯著低于對照組、MSC組和MSC轉染組（＝207.859，＜0.05）。在球囊損傷后28d時，對照組、MSC組和MSC轉染組的MMP-2 mRNA表達水平降低，但仍維持較高的表達量，3組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（＝0.423，＞0.05）；Dox組MMP-2 mRNA表達水平明顯降低，顯著低于對照組、MSC組和MSC轉染組（＝43.494，＜0.01；圖2）。

圖2 各組血管MMP-2 mRNA表達的比較

Figure 2 MMP-2 mRNA expression in the carotid artery

與對照組、MSC組和MSC轉染組,*＜0.05,**＜0.01; 與正常組比較,##＜0.01

2.4 雙重穩(wěn)定表達AT2R基因MSCs移植對血管損傷局部MMP-2 蛋白表達的影響

對MMP-2蛋白表達結果分析顯示，在正常組血管壁的中膜及外膜層可見存在于胞漿內(nèi)的MMP-2棕黃色陽性著色，其染色強度很弱，在胞漿內(nèi)散在分布；在球囊損傷后14d時，對照組、MSC組和MSC轉染組的MMP-2陽性染色顯著增強，主要于新生內(nèi)膜區(qū)出現(xiàn)較強陽性表達，3組間比較差異無統(tǒng)計學意義（＝0.815，＞0.05），三組均同時伴隨明顯的血管新生內(nèi)膜增生，造成明顯的管腔狹窄，三組間新生內(nèi)膜/中膜面積比（I/M）差異無統(tǒng)計學意義（1.43±0.21，＝0.235，＞0.05）。Dox組MMP-2在新生內(nèi)膜中的陽性表達與前三組相比顯著減弱（＝47.995，＜0.01），同時新生內(nèi)膜增生程度較其它各損傷組明顯減輕（I/M：0.81±0.11，＝72.417，＜0.01)。在球囊損傷后28d時，對照組、MSC組和MSC轉染組的新生內(nèi)膜區(qū)仍有較強的MMP-2陽性染色，與14d相比陽性強度減弱，三組間比較差異無統(tǒng)計學意義（＝0. 369，＞0.05）；Dox組MMP-2在新生內(nèi)膜中的陽性表達較14d時有明顯降低，與前3組相比顯著減弱（＝19.687，＜0.01；圖3，表1）。上述結果與MMP-2 mRNA檢測結果呈相同趨勢。

3 討 論

ECM是細胞生存的微環(huán)境，在人體的發(fā)育、細胞的分化與移行、信號轉導等生理過程和炎癥損傷修復等病理過程中具有重要功能和作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，血管損傷修復過程中，ECM與VSMCs之間存在著復雜的相互作用，ECM不僅是將VSMCs黏附在一起的連接物和支持物，而且對于VSMCs表型的轉變、遷移、增殖和凋亡都具有重要的影響[8]。

在正常動脈壁中ECM的合成與分解處于相對平衡，基質(zhì)成分相對穩(wěn)定。當血管內(nèi)皮經(jīng)受各種原因的損傷時，VSMCs由收縮型轉變?yōu)楹铣尚?，合成ECM的能力大大增加，同時降解ECM酶類的分泌也增加。因此，ECM的合成和降解達成一種新的動態(tài)平衡，即ECM重塑。伴隨著這種ECM重塑，血管壁細胞的生物學行為、血管壁的形態(tài)和功能均會發(fā)生改變[9]。

研究認為細胞周圍的ECM的迅速降解是VSMCs遷移與增殖初期的關鍵步驟之一，其中MMPs是一種特異性降解ECM各成分的內(nèi)源性鋅依賴性酶家族，被認為是最重要的一類基質(zhì)降解酶類[10]，對ECM有廣泛的降解作用。膠原是ECM的主要成分，血管壁細胞間膠原以I/Ⅲ型為主，Ⅳ型膠原參與基底膜的形成。MMP2是Ⅳ型膠原酶（明膠酶）的主要成員，其主要降解底物為Ⅳ、V和Ⅷ型膠原。在再狹窄病變中大量平滑肌細胞失去了收縮功能，以自分泌、旁分泌方式分泌大量MMPs，降解細胞外基質(zhì)。平滑肌細胞分泌的MMP-2、MMP-9可有效降解基底膜，為細胞遷移清掃道路[11]。動物實驗研究結果表明，用球囊導管對血管內(nèi)膜進行剝脫后第4～5d即有MMP-2表達增加，至7～14d左右達到峰值，并在較高水平上維持3～4周；應用MMP抑制劑可減少膠原的合成與降解，并使VSMCs從中膜向內(nèi)膜的遷移減少90%以上，因此認為MMP-2對血管損傷后的重塑具有重要的影響[12]。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以使培養(yǎng)的VSMCs的MMP-2表達顯著升高，認為MMP-2參與了由AngⅡ刺激產(chǎn)生的VSMCs遷移過程，采用Dox干預使該雙重穩(wěn)定VSMCs表達AT2R蛋白后，AngⅡ刺激所引起的MMP-2表達升高得到顯著抑制。在本實驗中，我們進一步于在體的研究中發(fā)現(xiàn)，球囊損傷血管內(nèi)皮后14d時MMP-2的表達出現(xiàn)顯著增高，并且表達主要位于新生內(nèi)膜區(qū)，被破壞了內(nèi)彈力板附近的向內(nèi)膜區(qū)遷移增生的VSMCs亦可見明顯表達；術后28d時MMP-2仍維持較高的表達。Dox組AT2R蛋白表達明顯增加，同時發(fā)現(xiàn)MMP-2在彈力板附近的向內(nèi)膜區(qū)遷移增生的VSMCs中可見較少量表達，而新生內(nèi)膜區(qū)表達顯著降低。MSC組與MSC轉染組血管中MMP-2的表達水平與對照組無明顯差異。通過以上的研究結果推測認為，血管內(nèi)皮損傷后修復過程中，在多種細胞因子的作用下，膠原的合成與降解都加快，由于MMP-2的高表達，可促進損傷修復早期膠原降解加速，進而促進了VSMCs的遷移與早期增殖；可調(diào)控的AT2R基因激活后抑制MMP-2表達，降低了膠原在損傷早期的降解，使膠原的合成與降解之間達到早期平衡，從而可減弱血管內(nèi)皮損傷后VSMCs的遷移、增生，進而可能減輕新生內(nèi)膜形成過程中的結構重塑，降低再狹窄的發(fā)生率。

表1 各組血管中MMP-2蛋白表達圖像分析結果

注: 與正常組比較,＜0.01; 與對照組、MSC組及MSC轉染組比較,##＜0.01

圖3 頸動脈MMP-2表達的免疫組化檢測

Figure 3 Immunohistochemisty of MMP-2 expression in arterial walls (染色方法×400)

A: 對照組; B: MSC組; C: MSC轉染組; D: Dox組

上述研究結果提示，雙重穩(wěn)定表達AT2R基因的MSCs導入損傷血管后，在Dox的調(diào)控下上調(diào)AT2R基因的表達，并且通過調(diào)節(jié)損傷血管修復過程中ECM的表達，可能是AT2R介導抑制新生內(nèi)膜過度增生的機制之一。

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（編輯: 王雪萍）

Effect of regulatable expression of AT2R on MMP-2 expression in neointima after vascular injury in rats

JING Tao1, LIU Jianping1, MIAO Li1, Feng Jian2, RAN Boli1, WANG Haidong3, HE Guoxiang1*

(1Department of Cardiology,3Department of Cardiothoracic Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China;2Department of Cardiology, Affiliated Hospital, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

To evaluate the role of regulatable expression of AT2R geneon the expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in the neointima after vascular injury in rats by deoxycycline (Dox)-on mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation.Two successive rounds of transfection of cultured MSCs were performed with conventional molecular biological methods. MSCs with low background expression and high Dox-induced expression of AT2R gene were deemed double-stable MSCs. Rat models of balloon-induced carotid injury were established. Double-stable MSCs were then transplanted into the site of carotid injury, and Dox was injectedvena caudalis into rats. Pathological study was carried out at 14d and 28d after cell transplantation. AT2R gene expression in the neointima and its effect on the mRNA and protein expression of MMP-2 were analyzed by immunohistochemistry, immunoblotting and RT-PCR.Double stable MSCs line with low background expression and high Dox induced expression of AT2R gene was established successfully. Significant AT2R expression was observed after 48h of induction and further increased after 72h and remained stable over 8 weeks. Immunohistochemistry, immunoblotting and RT-PCR indicated that AT2R expression in the neointima was significantly upregulated in Dox group than in control group, MSC group and MSC transfection group (＜0.01), but the expression of MMP-2 was significantly decreased in Dox group than in other groups (＜0.01).AT2R expression at the site of carotid injury after transfection of our double-stable MSCs were well controlled by Dox. After Dox induces the high expression of AT2R, the expression of MMP-2 in neointima is decreased, which may be one of the mechanisms of regulating AT2R expression in injured vessels to prevent vascular restenosis.

AT2R; regulatable expression; mesenchymal stem cell; neointimal hyperplasia; matrix metalloproteinase

(No. 30400180)

R543.3

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00055

2012-12-19;

2013-01-28

國家自然科學基金（No.30400180）

何國祥, Tel: 023-68754118, E-mail: yyxnk@yahoo.com.cn