田瑞敏，鄢佳程，王含彥，易 芳，陳建業(yè)△

（川北醫(yī)學院：1.應用技術研究所；2.生物化學教研室，四川南充637000）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術是利用雙鏈RNA（double－stranded RNA，dsRNA），高效、特異性降解細胞內同源信使RNA（messenger RNA，mRNA），從而阻斷特定基因表達，使細胞出現靶基因缺失的表型。1998年Fire等［1］首次應用RNAi技術將dsRNA正義鏈與反義鏈的混合物注入線蟲體內，結果發(fā)現注入dsRNA比單獨注入單鏈RNA引起的基因沉默要強得多，并可導致子一代同源基因的沉默。2001年Elbashir等［2］在哺乳動物細胞中首次觀測到了RNAi現象，從而開啟了RNAi技術在哺乳動物細胞中應用研究的閘門，使RNAi技術迅速成為后基因組時代基因功能研究和基因治療研究領域最熱門的研究工具之一，進而得到廣泛應用。迄今為止，RNAi的確切機制尚不清楚。經過10多年的研究，一些細節(jié)逐漸展現在人們面前。本文就現階段RNAi已知的可能機制及RNAi技術在腫瘤基因治療中的研究現狀作一綜述。

1 RNAi的作用機制

有關RNAi現象的機制研究主要集中在線蟲、果蠅等低等動物，許多研究初步闡明了RNAi抑制mRNA轉錄與翻譯的分子機制［3－6］：在RNAi引起基因沉默的過程中，細胞內具有核糖核酸酶Ⅲ（ribonucleaseⅢ，RnaseⅢ）活性的核酸酶Dicer首先識別外源性或內源性dsRNA，將其切割成21～23nt大小的siRNA（small interfering RNA，siRNA）；隨后siRNA與無活性的RNA誘導沉默復合物（RNA－induced silencing complex，RISC）結合，在解螺旋酶的作用下siRNA雙鏈解開為單鏈；由于siRNA與mRNA具有高度同源性，其反義鏈通過與靶基因mRNA進行特異性結合使RISC活化，最后將靶基因mRNA剪切成碎片。同時，siRNA還可作為合成dsRNA的引物，引物siRNA與靶基因mRNA模板結合后，在RNA依賴性RNA聚合酶的催化下，合成新的dsRNA，后者被Dicer剪切成新的siRNA，從而產生級聯放大效應，增強靶基因的沉默效應［4］。此外，siRNA還可引起同源基因組DNA產生RNA定導甲基化、基因缺失、表型缺陷等系列分子生物學效應［7］，進一步強化基因沉默效應。

2 RNAi技術在腫瘤基因治療中的研究現狀

腫瘤是機體在多種致癌因素作用下，局部組織細胞內的癌基因與抑癌基因表達失衡，引起細胞分裂與生長的多基因調控網絡失調，導致細胞異常分裂、生長與分化而形成的病理性新生物。因此，只針對單個突變基因進行的腫瘤基因治療，效果并不明顯。Matsui等［8］研究發(fā)現，RNAi技術對于內源性和外源性基因都有明顯的沉默作用。因此，利用同一基因家族的多個基因具有高度保守同源序列的特性，通過RNAi技術設計一種特異性的dsRNA分子，就可以同時剔除多個同源基因，從而達到腫瘤基因治療的目的。此外，RNAi能同時抑制腫瘤多個不同的基因，而且抑制作用互不影響，這就為由于多基因改變和多因素引起的腫瘤的治療提供了可能［9］。目前，RNAi對腫瘤進行基因治療主要集中在腫瘤發(fā)生和腫瘤轉移相關基因（如癌基因、抑癌基因、腫瘤轉移相關基因）以及與腫瘤耐藥基因、細胞凋亡、信號轉導、有絲分裂有關的基因方面。

2.1 RNAi對腫瘤發(fā)生與轉移相關基因的沉默作用 基于RNAi技術在基因功能沉默與功能抑制中的優(yōu)勢，利用該技術抑制腫瘤細胞內癌基因的功能表達，分析其表型變化，可以幫助進一步發(fā)現腫瘤發(fā)生與發(fā)展的分子機制，為腫瘤的基因治療提供可靠的理論依據。

沉默信息調節(jié)因子2同源蛋白（silent mating type information regulation 2homolog 1，SIRT1）是一種涉及從腫瘤發(fā)生到衰老多個層面不同細胞過程的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白去乙酰酶，在肝細胞性肝癌和肝細胞癌細胞株中均高表達。Choi等［10］通過RNAi技術用化學合成的siRNA沉默肝癌細胞中SIRT1基因的表達，發(fā)現肝癌細胞的生長與細胞周期進程被有效阻滯。核小體結合蛋白－1（nucleosome binding protein－1，NSBP1）是 HMGN蛋白家族成員，能夠結合核小體并通過染色質重建調節(jié)基因轉錄，NSBP1的表達與腫瘤分級、病理分期和淋巴結轉移密切相關；NSBP1基因的過表達促進癌細胞的生長與轉移，增強癌細胞的侵襲力。Wahafu等［11］研究結果顯示，導致癌細胞生存率降低、細胞周期素B1表達降低、細胞周期被阻滯在G2／M期。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管發(fā)生、內皮細胞形成和增殖中發(fā)揮重要作用。內皮癌時，由于VEGF分泌增多，從而促進了內皮細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡和誘導血管透化。研究發(fā)現，人結直腸癌患者體內的血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）表達常常過高，它還與腫瘤的進行性和侵襲力相關。Qiu等［12］采用慢病毒包裝針對VEGFA基因的RNAi載體，并導入結直腸癌細胞RKO cell后發(fā)現，VEGFA表達被抑制后，可以抑制腫瘤細胞的生長、遷移和增殖。另外，VEGFA基因沉默也可以減少促分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 （mitogen－activated protein kinase，MAPK）信號肽和第2個線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑／低等電點凋亡抑制蛋白直接結合蛋白（second mitochondria－derived activator ofcaspase／direct IAP binding proteinwith low PI，Smac／DIABLO）的表達，這都說明了用RNAi的方法沉默VEGFA表達，可以成為治療結直腸癌的一種基因治療方法。這些研究表明，利用RNAi技術沉默或者關閉與腫瘤發(fā)生相關的基因，可能是今后腫瘤治療的一種新的策略。

2.2 RNAi對腫瘤耐藥相關基因的沉默作用 除手術治療外，放療和化療在腫瘤的治療中是最重要的兩種輔助治療方法。惡性腫瘤復發(fā)與化療效果不佳甚至失敗有重要關系，影響化療效果的主要原因是腫瘤細胞容易產生耐藥性，表現為原藥耐藥和多藥耐藥。采用RNAi的方法可以減少腫瘤的耐藥性，增加腫瘤對放、化療藥物的敏感性。

多藥抗性蛋白質1／P糖蛋白（multidrug resistance protein 1／P－glycoprotein，MDR1／P－gp）的過表達被認為與腫瘤組織多藥抗藥性相關。上皮－間質轉化及其轉錄調控因子（twist－related protein 1，Twist1）是一種高度保守的轉錄蛋白，屬于螺旋－環(huán)－螺旋蛋白家族，在上皮細胞－間充質細胞轉換中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，從而可以促進腫瘤發(fā)生轉移。Zhu等［13］首次發(fā)現了Twist1和MDR1／P－gp的關系，他們在人宮頸癌HeLa細胞中通過RNAi的方法干擾Twist1的表達后發(fā)現可以下調MDR1／P－gp的表達，可以抑制腫瘤細胞增殖和增強腫瘤細胞對順鉑化療的敏感性。

研究發(fā)現，細胞周期蛋白d1（cyclin D1）與多種腫瘤治療過程中的化療抗藥性和放療抵抗有關。Kothari等［14］通過RNAi的方法沉默cyclin D1基因在頭頸部鱗狀細胞癌的表達，然后檢測細胞對順鉑的敏感性，發(fā)現沉默了cyclin D1基因的腫瘤細胞周期延遲，減慢了腫瘤進展，并且對順鉑的敏感性提高。

2.3 RNAi對細胞凋亡相關基因的沉默作用 細胞凋亡是受許多基因調控的細胞清除的正常途徑，細胞凋亡調控基因的表達紊亂與許多腫瘤的發(fā)生密切相關。B細胞淋巴瘤－白血?。?蛋白質家族（B cell lymphoma／leukemia－2，Bcl－2）、B細胞白血病－長x Bcl－2家族成員之一（B cell leukemia－x long，Bcl－xL）、surviving、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白（X－linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）和FLICE抑制蛋白（FLICE inhibitory protein，FLIP）是常見的抗凋亡蛋白，通常在腫瘤細胞中過量表達，刺激腫瘤細胞異常生長，對凋亡誘導因素產生抵抗作用。因此，不斷尋找新的抗凋亡蛋白然后利用RNAi技術沉默或下調腫瘤細胞中抗凋亡蛋白的表達，對腫瘤治療具有重要的理論意義和實踐價值。

許多研究證實，survivin基因在腫瘤細胞中過表達，抑制survivin基因的表達，能夠導致多種腫瘤的生長抑制。Wang等［15］利用RNAi技術將針對survivin基因的dsRNA轉入食管鱗狀細胞癌細胞系和動物模型中，結果發(fā)現，下調survivin基因的表達，能夠顯著誘導腫瘤細胞凋亡、抑制動物模型實體瘤的生長。XIAP是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，能夠選擇性抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3、－7、－9（caspase－3、－7、－9），還能通過其他途徑抑制細胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后關系密切。Hiscutt等［16］根據美國聯合委員會癌癥分期系統(tǒng)標準對55例皮膚原發(fā)性黑色素瘤細胞病變進行篩選和分組，通過XIAP特異性siRNA干擾黑素瘤細胞中XIAP的表達，發(fā)現XIAP的表達促進黑色素瘤細胞病變的進程，XIAP的沉默或表達下調顯著誘導黑色素瘤細胞的凋亡，提示XIAP可以作為黑色素瘤基因治療的一個有效的治療靶點。

2.4 RNAi對腫瘤信號通路相關基因的沉默作用 腎素－血管緊張素系統(tǒng) （renin－angiotensin system，Ras）、腫瘤抑制蛋白（suppressor protein53，p53）、酪氨酸蛋白激酶類（protein tyrosine kinase，PTKs）信號通路是腫瘤發(fā)生常見的信號通路。PTKs是重要的細胞信號轉導分子，在人類多種腫瘤發(fā)生過程中常常發(fā)生突變，通過基因重排如染色體易位產生潛在的致癌性結合蛋白，導致細胞在激酶活性水平發(fā)生改變。斷裂點聚集區(qū)－Abelson小鼠白血病病毒癌基因同源物結合蛋白（breakpoint－cluster region－Abelson murine leukemia viral oncogene homolog，Bcr－Abl）是PTKs的一種突變產物，在人類慢性白血病細胞內普遍存在，用siRNA特異性沉默Bcr－Abl的轉錄，可以誘導白血病細胞凋亡［17］。β－連接素和腺瘤結腸息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）都是 Wint信號通路的重要成員，與細胞增殖調控密切相關。APC基因突變會上調β－連接素的表達水平，促進腫瘤細胞增殖。運用siRNA技術沉默β－連接素的表達可以引起β－連接素依賴性相關基因的表達下調，從而抑制腫瘤細胞的生長［18］。以上研究提示，可以運用RNAi技術沉默腫瘤信號通路中的關鍵或相關基因的表達，達到腫瘤基因治療的目的。信號傳導蛋白和轉錄激活物5（signal transducer and activator of transcription 5，Stat5）在人的多種腫瘤中被發(fā)現高表達。抑制腫瘤細胞中Stat5的表達被認為與抑制腫瘤細胞的增殖和促進凋亡相關。Zhang等［19］以人的肝細胞癌細胞系SMMC7721為細胞模型，檢測到Stat5在SMMC7721細胞中高表達，然后發(fā)現用RNAi介導的Stat5基因沉默可以抑制腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡。

2.5 RNAi對腫瘤細胞有絲分裂相關基因的沉默作用 腫瘤細胞的無限繁殖伴隨著細胞DNA的快速復制與細胞分裂的不斷進行，利用RNAi技術沉默腫瘤細胞周期調控基因，中斷細胞分裂進程，減慢或停止腫瘤細胞增殖，從而使腫瘤根治成為可能。目前研究較多的腫瘤細胞有絲分裂調控基因有polo樣激酶1（polo－like kinase 1，PLK1）、S相激酶關聯蛋白2（S－phase kinase associated protein，Skp－2）、細胞周期素（cyclins）等。PLK1在細胞分裂不同時期都具有十分重要的作用，能夠促進和加速有絲分裂，增加PLK1的活性能夠促進M期細胞增殖。Sp?nkuch－Schmitt等［20］用 RNA 干擾技術分別沉默乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌細胞系中PLK1的表達，許多癌細胞出現了紡錘體形成受阻、有絲分裂停止等微觀形態(tài)變化。SKP2是細胞從G1期進入S期的必需因子，能夠促進細胞增殖，加速細胞周期進程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系十分密切。研究發(fā)現，當用RNAi技術沉默人小細胞肺癌細胞中SKP2的表達，癌細胞的生長則受到明顯的抑制［21］。細胞周期素是細胞周期進程的主要引擎分子，在細胞增殖過程中發(fā)揮關鍵調控作用。研究證明，通過RNAi方法沉默裸鼠肝癌細胞中細胞周期素E（cyclin E）的表達，可以抑制癌細胞生長與增殖，促進癌細胞 凋 亡［22］。 紡 錘 體 驅 動 蛋 白 （kinesin－like spindle protein，KSP）是微管驅動蛋白超家族的成員之一，在有絲分裂中關于紡錘體的形成、分布和維護中發(fā)揮重要作用。若抑制KSP的功能，可以使細胞有絲分裂周期停滯，最終導致細胞死亡。Marra等［23］通過電轉移法轉染siRNA進入某些確定損傷的組織中發(fā)現，KSP特異性的小干擾RNA可以顯著減輕皮下黑色素瘤和卵巢癌的損害。

3 RNAi技術在腫瘤基因治療方面的主要問題與前景展望

目前，RNAi技術在腫瘤基因治療方面僅僅停留在細胞與動物實驗水平，雖然顯示出種種優(yōu)勢與可行性，但還存在著許多不容忽視的問題，離實際應用還有漫長的路要走。首先，RNAi對基因沉默具有相對特異性，可能出現脫靶現象［24］。這就需要從siRNA的設計、特異性修飾等方面來改善。其次，siRNA的設計和篩選上還存盲目性。一種完全符合腫瘤基因治療要求的siRNA需要經過反復實驗才能篩選出有效作用位點，這一現狀需要更多的實驗研究從實驗原理和技術方法上來加以完善。此外，siRNA導入腫瘤細胞后可能與細胞內原有微RNA（microRNA，miRNA）形成競爭，這種競爭作用可能會影響腫瘤細胞內原本由miRNA控制的一些基因的表達，從而影響細胞的生理病理過程［25］，這就要求不斷發(fā)現和深入研究新的miRNA序列，以解決siRNA與miRNA間的競爭問題。最后，siRNA體內轉染效率低下、對機體的長期影響尚屬空白，這是RNAi技術應用于臨床的最大難題。各類表達載體的安全性及合成RNA的不良反應，也限制了其應用于臨床［26］。

傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如放、化療存在著諸多局限性，隨著RNAi的發(fā)現，為腫瘤的基因治療帶來了希望之光。RNAi技術在腫瘤基因治療的實驗研究上已經取得了諸多成果，有望在此基礎上研究出治療腫瘤的核酸藥物，單獨或者與其他方法聯合用于治療腫瘤。雖然，目前RNAi技術應用于臨床還有一定的距離，但有理由相信隨著新靶標的不斷發(fā)現、RNAi技術難題的不斷破解和安全性的不斷提高，腫瘤基因治療的目標終究會實現。

［1］ Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806－811.

［2］ Elbashir SM，Martinez J，Patkaniowska A，et al.Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate［J］.EMBO J，2001，20（23）：6877－6888.

［3］ Heo I，Kim VN.Regulating the regulators：posttranslational modifications of RNA silencing factors［J］.Cell，2009，139（1）：28－31.

［4］ Gregory J，Hannon.RNA interference［J］.Nature，2002，418（6894）：244－251.

［5］ Sashital DG，Doudna JA.Structural insights into RNA interference［J］.Curr Opin Struct Biol，2010，20（1）：90－97.

［6］ Rana TM.Illuminating the silence：understanding the structure and function of small RNAs［J］.Nature Rev Mol Cell Biol，2007，8（1）：23－36.

［7］ Mahmood ur－Rahman，Ali I，Husnain T，et al.RNA interference：The stroy of gene silencing in plants and human［J］.Biotechnol Adv，2008，26（3）：202－209.

［8］ Matsui K，Sasaki Y，Komatsu T，et al.RNAi gene silencing using cerasome as a viral－size siRNA－carrier free from fusion and cross－linking［J］.Bioorg Med Chem Lett，2007，17（14）：3935－3938.

［9］Jacque JM，Karjne T，Stevenson M.Modulation of HIV－lreplication by RNA interference［J］.Nature，2002，418（6896）：435－438.

［10］Choi HN，Bae JS，Jamiyandorj U，et al.Expression and role of SIRT1in hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Rep，2011，26（2）：503－510.

［11］Wahafu W，He ZS，Zhang XY，et al.The nucleosome binding protein NSBP1is highly expressed in human bladder cancer and promotes the proliferation and invasion of bladder cancer cells［J］.Tumour Biol，2011，32（5）：931－939.

［12］Qiu JF，Zhang ZQ，Yong W，et al.Lentivirus－mediated RNAi knockdown of VEGFA in RKO colorectal cancer cells decreases tumor formation and growth in vitro and in vivo［J］.Clin Exp Pathol，2012，5（4）：290－298.

［13］Zhu K，Chen L，Han X，et al.Short hairpin RNA targeting Twist1suppresses cell proliferation and improves chemosensitivity to cisplatin in HeLa human cervical cancer cells［J］.Oncol Rep，2012，27（4）：1027－1034.

［14］Kothari V，Mulherkar R.Inhibition of cyclin D1by shRNA is associated with enhanced sensitivity to conventional therapies for head and neck squamous cell carcinoma［J］.Anticancer Res，2012，32（1）：121－128.

［15］Wang Y，Zhu H，Quan L，et al.Downregulation of survivin by RNAi inhibits the growth of esophageal carcinoma cells［J］.Cancer Biol Ther，2005，4（9）：974－978.

［16］Hiscutt EL，Hill DS，Martin S，et al.Targeting X－linked inhibitor of apoptosis protein to increase the efficacy of endoplasmic reticulum stress－induced apoptosis for melanoma therapy［J］.Invest Dermato，2010，130（9）：2250－2258.

［17］Zaree Mahmodabady A，Javadi HR，Kamali M，et al.Bcrabl silencing by specific small－interference RNA expression vector as a potential treatment for chronic myeloid leukemia［J］.Iran Biomed J，2010，14（1／2）：1－8.

［18］Xu WL，Wang Q，Du M，et al.Growth inhibition effect of beta－catenin small interfering RNA－mediated gene silencing on human colon carcinoma HT－29cells［J］.Cancer Biother Radiopharm，2010，25（5）：529－537.

［19］Zhang L，Zhao Z，Feng Z，et al.RNA interference－mediated silencing of Stat5induces apoptosis and growth suppression of hepatocellular carcinoma cells［J］.Neoplasma，2012，59（3）：302－309.

［20］Sp?nkuch－Schmitt B，Bereiter－Hahn J，Kaufmann M，et al.Effect of RNA silencing of polo－like kinase－1（PLK1）on apoptosis and spindle formation in human cancer cells［J］.Natl Cancer Inst，2002，94（24）：1863－1877.

［21］Sumimoto H，Miyagishi M，Miyoshi H，et al.Inhibition of growth and invasive ability of melanoma by inactivation of mutated BRAF with lentivirus－mediated RNA interfer－ence［J］.Oncogene，2004，23（36）：6031－6039.

［22］Li K，Lin SY，Brunicardi FC，et al.Use of RNA interference to target cyclin E－overexpressing hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2003，63（13）：3593－3597.

［23］Marra E，Palombo F，Ciliberto G，et al.Intratumoral electro－transfer of small interfering RNA against kinesin spindle protein（KSP）slows down tumor progression［J］.Cell Physiol，2012May 2.doi：10.1002／jcp.24103.

［24］Rassouli FB，Matin MM.Ene silencing in human embryonic stem cells by RNA interference［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，390（4）：1106－1110.

［25］李高峰，王宏梅，陳龍華.RNAi對肝癌細胞放射增敏的實驗研究［J］.重慶醫(yī)學，2010，39（12）：1492－1496.

［26］Higuchi Y，Kawakami S，Hashida M，et al.Strategies for in vivo delivery of siRNAs：recent progress［J］.Bio Drugs，2010，24（3）：195－205.