王志華 張普 朱偉 張慶勇，＊

心肌微血管結(jié)構(gòu)和功能變化在心血管疾病如冠心病、高血壓和糖尿病心肌病病變過程中發(fā)揮著重要作用［1，2］。心肌微血管的新生是心肌細(xì)胞種植、心肌重塑成功與否的關(guān)鍵，因此，建立有效的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MMVECs）體外培養(yǎng)體系能為進(jìn)一步深入研究心血管相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理及治療提供重要的細(xì)胞模型。由于心肌微血管段分離步驟復(fù)雜，所用培養(yǎng)方法如灌注法、酶消化法等存在一些問題，使獲得的內(nèi)皮細(xì)胞量較少，純度也不高。故目前的相關(guān)體外研究多采用容易得到的大血管內(nèi)皮細(xì)胞，如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞或主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞等。但是，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的器官特異性和組織特異性［3］，利用大血管內(nèi)皮細(xì)胞研究的結(jié)果很難客觀、準(zhǔn)確地解釋MVECs病變［4］。本研究以文獻(xiàn)報(bào)道的貼塊法為基礎(chǔ)［5，6］，通過心肌組織貼塊法和培養(yǎng)液中加用肝素的方法建立了簡(jiǎn)單、快速、可靠，且可獲得高純度MMVECs的體外培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

倒置顯微鏡、倒置分光熒光顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)（Leica，德國(guó)）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國(guó)）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 動(dòng)物和試劑

選用6～8周齡Wistar雄性大鼠（約60～100g）（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（Invitrogen，美國(guó)）；鼠尾膠（自制）；胰蛋白酶（1∶250，Ameresco，美國(guó)）；胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)）；兔抗鼠CD34單克隆抗體、兔抗鼠CD31單克隆抗體（Antibody Diagnostica Inc，美國(guó)）；兔抗人VIII因子相關(guān)抗原多克隆抗體（DAKO，丹麥）；抗兔及抗鼠ABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、FITC 標(biāo)記羊抗兔IgG（Beyotime，中國(guó)）；其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純商品。

1.3 實(shí)驗(yàn)用肝素的配制

市售肝素鈉注射液（12500U，1ml／安瓿，批號(hào)：H32020612，萬邦醫(yī)藥，江蘇）加入24ml生理鹽水中，用0.22μm 針頭濾器抽濾，即成500U／ml的母液。使用前加入適量20%FBS DMEM 高糖培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中肝素濃度為20U／ml。

1.4 植塊法培養(yǎng)大鼠MMVECs

Wistar大鼠3～5只，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，再腹腔內(nèi)注射200U 肝素。將大鼠于75%乙醇浸泡消毒30min后移至超凈工作臺(tái)進(jìn)行操作：逐層打開胸腔，暴露心臟，剪開心包，由升主動(dòng)脈處剪下心臟，放入PBS緩沖液中，將心腔中的血液沖洗干凈，辨清心臟解剖結(jié)構(gòu)，去除大血管、左右心房以及右心室和室間隔，保留左心室，小心去除心內(nèi)膜及心外膜，用眼科剪將心室肌剪成若干大小約2mm3小塊，均勻接種于鼠尾膠預(yù)處理過的培養(yǎng)皿中，組織塊間隔1～3mm，滴加少許FBS，置37℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱靜置培養(yǎng)，使其貼壁；約40min后加入5ml含20%FBS DMEM 高糖培養(yǎng)液；約48h后用倒置顯微鏡觀察，若組織塊周圍有細(xì)胞長(zhǎng)出，則更換一半上述培養(yǎng)液，約70h去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)36h。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿皿底80%～90%后，用含0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。選取第二代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.5 MMVECs鑒定

采用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色法對(duì)MMVECs進(jìn)行鑒定。CD31和CD34分別參照抗兔及抗鼠ABC試劑盒說明書操作，細(xì)胞和細(xì)胞核染成棕褐色為陽性；VIII因子抗體采用FITC標(biāo)記，胞漿呈紅色熒光；實(shí)驗(yàn)中用PBS作陰性對(duì)照?？贵w稀釋比例：CD34、CD31為1∶500，VIII因子為1∶200。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)MMVECs形態(tài)學(xué)觀察

采用心肌組織塊貼壁培養(yǎng)約48h 可見到MMVECs從組織塊周圍爬出，約70h 可見到組織塊周圍MMVECs明顯增多，組織塊之間內(nèi)皮細(xì)胞可連接成片。去除組織塊后約36h，MMVECs可以生長(zhǎng)融合至80%～90%，呈典型鋪路石樣形態(tài)。見圖1。

2.2 培養(yǎng)MMVECs鑒定

CD31染色顯示所有MMVECs均染成棕褐色，細(xì)胞輪廓清晰。CD34染色顯示細(xì)胞核染成棕褐色，以核周胞漿最為明顯。VIII因子相關(guān)抗原染色顯示胞漿呈紅色熒光，以核周胞漿最明顯。用PBS代替一抗染色的細(xì)胞未見特異性顯色，為陰性反應(yīng)。證實(shí)培養(yǎng)的MMVECs純度很高。見圖2。

［本文圖1、圖2見封4］

3 討論

目前分離培養(yǎng)MVECs以酶消化法常用，因?yàn)樵摲椒ǐ@得的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)快，數(shù)量多，純度高。但是酶消化法也存在一些缺點(diǎn)：（1）消化酶價(jià)格較貴。（2）在消化過程中如何掌握酶的濃度和消化時(shí)間難度較大。酶濃度過高或消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞從血管段脫落后被消化破壞而死亡，沒有被消化破壞的細(xì)胞貼壁差，生長(zhǎng)慢；而酶濃度過低或消化時(shí)間過短，則分離效果差，獲得的MVECs數(shù)量少。本研究采用改良貼塊法培養(yǎng)MVECs，主要?jiǎng)?chuàng)新在于：（1）腹腔內(nèi)注射肝素使貼塊后游出的血細(xì)胞不發(fā)生凝固而堵塞微血管，以利MVECs生長(zhǎng)。筆者預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在貼塊培養(yǎng)過程中，血細(xì)胞首先游出，過多游出的血細(xì)胞既妨礙MVECs生長(zhǎng)，又容易阻塞微血管，也妨礙MVECs 游出；腹腔內(nèi)注射肝素還有利于PBS對(duì)組織塊的徹底清洗，清除血細(xì)胞的影響。（2）培養(yǎng)液中加入肝素可促進(jìn)MVECs生長(zhǎng)及提高其純度。應(yīng)用貼塊法獲得更多MVECs的方法通常是延長(zhǎng)去組織塊的時(shí)間，這樣就會(huì)存在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響MVECs純度的風(fēng)險(xiǎn)。通過在培養(yǎng)液中加入適量肝素，縮短去組織塊時(shí)間，可顯著提高M(jìn)VECs的純度，這與肝素本身可能有促進(jìn)MVECs生長(zhǎng)，以及細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子與肝素結(jié)合而共同促進(jìn)MVECs生長(zhǎng)［7］有關(guān)。

MVECs一般呈單層生長(zhǎng)，呈多邊形或梭形，有接觸抑制現(xiàn)象，細(xì)胞密度較高時(shí)呈鋪路石樣生長(zhǎng)，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。CD31和VIII因子相關(guān)抗原是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，尤其后者為內(nèi)皮細(xì)胞所特有，MVECs除了表達(dá)VIII因子和CD31外，還可表達(dá)MVECs的特異性分子標(biāo)志CD34［4］。本研究從心肌組織培養(yǎng)的MVECs表現(xiàn)出典型的單層鵝卵石樣排列［5］；通過免疫組化和免疫熒光染色表明，MMVECs 能明顯表達(dá)VIII因子、CD31和CD34［8、9］，證明通過改良貼塊法所獲得的細(xì)胞確實(shí)是MVECs，而且純度很高。

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