任海濤，鐘志勇，嚴家榮，饒子亮，黃紅坤，黃小瓊，武 昕，唐小江

生物醫(yī)學材料是近30年來發(fā)展起來的一類高技術新材料，其中的可吸收止血材料也隨著交通意外、重大災害等事故的增多逐漸引起醫(yī)學界的關注。因此，止血效果確切、生物相容性好又能控制降解速率的生物醫(yī)用止血材料成為人們關注和研究的主要對象。當前的生物止血材料主要有纖維蛋白膠、殼聚糖類止血材料、可吸收性明膠海綿、氧化纖維素等。纖維蛋白膠是從人或哺乳動物血中提取的一種生物止血黏合劑［1］，使用時要先溶解，不僅增加了儲存和運輸?shù)碾y度，而且限制了應用［2］。殼聚糖是廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌和植物的細胞壁中的甲殼素經脫乙?；蟮囊环N天然的高分子材料，與人體生物相容性好，具有生物降解性［3］。其止血機制是通過對紅細胞的作用，使紅細胞發(fā)生聚集從而使血液凝固，但其止血作用有限［4］。明膠海綿是由從動物皮膚中提取并經純化的明膠制作而成。明膠是膠原的水解產物，通過激活血小板，促進凝血塊形成，達到止血目的［5］，其與血液形成的凝膠較易溶解［6］;同時，明膠海綿需機體的凝血因子參與才能止血，對凝血機制障礙者止血效果不理想［7］。氧化纖維素的止血機制是其分子中具有的酸性羧基與血紅蛋白中Fe3+結合，形成棕色膠塊，封閉毛細血管末段而止血［8］，但其酸性均能破壞凝血酶的止血作用［9］。膠原蛋白海綿作為一種新型的止血材料，利用其大面積的海綿結構破壞血小板來促進凝血過程。海綿在創(chuàng)面的溶解或降解而產生局部黏度變化從而促進凝血過程。鼠尾膠原蛋白海綿用于止血作用的研究還未見相關文獻報道。本文研究鼠尾膠原蛋白海綿止血作用，為鼠尾膠原蛋白海綿用于止血、創(chuàng)面修復及進一步研究其止血機制提供事實依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭兔，普通級，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供［生產許可證號 SCXK(粵)2008-0002］;使用許可證號［SYXK(粵)2008-0002］。本實驗通過了廣東省醫(yī)學實驗動物中心倫理審查委員會的審查，動物質量合格證編號0098038，實驗編號SC11262。

1.1.2 儀器與試劑 30N冷凍干燥系統(tǒng)(寧波新芝公司);萬分之一天平(德國Sartorius公司);SRMCD47醫(yī)用保存柜(日本Sanyo公司);YP6000N系列電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

膠原蛋白海綿，廣州創(chuàng)爾生物技術有限公司生產，批號20101203。麻醉藥:賽拉嗪，吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司，批號20091206;戊巴比妥鈉，廣州白云區(qū)思樂實驗儀器營業(yè)部，批號100808。

1.2 方法 實驗方法采用低溫冷凍干燥工藝制備鼠尾膠原蛋白海綿［10］，對鼠尾膠原蛋白海綿的止血療效、止血可靠性及創(chuàng)面愈合、體內吸收情況進行初步研究，并用膠原蛋白海綿作參照。所用動物為2.0～3.0 kg的新西蘭大白兔，隨機分為對照組、膠原蛋白海綿組、鼠尾膠原海綿組。

1.2.1 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳部靜脈出血的止血研究 聯(lián)合麻醉對照組、膠原蛋白海綿組、鼠尾膠原海綿組，5只/組。在耳緣靜脈周圍處去毛并用手指輕彈若干次。每只兔分別于距耳尖部8 cm處割斷耳緣靜脈，自由出血5 s。5 s后對照組壓敷消毒棉花、膠原蛋白海綿組壓敷膠原蛋白海綿、鼠尾膠原海綿組壓敷鼠尾膠原蛋白海綿。使用2 kg砝碼作為外力進行傷口處按壓，每隔30 s觀察傷口的流血情況，并用藥棉吸附所出血液。記錄從切斷靜脈至不再出血的時間，同時觀察壓敷止血10 min、60 min、6 h、12 h、24 h、48 h 止血材料有無脫落和再出血現(xiàn)象。

1.2.2 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳部動脈出血的止血研究 分組和實驗方法同1.2.1，每只兔分別于距耳尖部8 cm處割斷耳緣動脈，記錄從切斷動脈至不再出血的時間，觀察止血材料有無脫落和再出血現(xiàn)象的時間同1.2.1。

1.2.3 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔肝臟創(chuàng)面出血的止血研究 分組和實驗方法同1.2.1，無菌條件下剖開動物腹腔暴露肝臟，用無菌手術刀在肝臟表面以“#”型進行2 cm×3 cm面積的劃傷，每隔30 s觀察傷口的流血情況，并用藥棉吸附所出血液。記錄從劃傷肝臟至不再出血的時間。

1.2.4 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔股動脈割傷出血的止血研究 分組和實驗方法同1.2.1，將實驗動物固定在實驗臺，無菌條件下鈍性分離股動脈，將股動脈切開3/4，每隔30 s觀察傷口的流血情況，并用藥棉吸附所出血液。記錄從切傷股動脈至不再出血的時間。

2 結果

結果如表1所示，耳緣靜脈出血:鼠尾膠原海綿組、膠原蛋白海綿組出血時間與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而鼠尾膠原海綿組與膠原蛋白海綿組比較，差異無統(tǒng)計學意義。耳緣動脈出血:鼠尾膠原海綿組出血時間與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與膠原蛋白海綿組比較，差異無統(tǒng)計學意義。肝臟出血:鼠尾膠原海綿組出血時間與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與膠原蛋白海綿組比較，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。股動脈出血:鼠尾膠原海綿組出血時間與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與膠原蛋白海綿組比較，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳緣靜脈、耳緣動脈、肝臟、股動脈止血時間的影響(±s)

表1 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳緣靜脈、耳緣動脈、肝臟、股動脈止血時間的影響(±s)

注:與對照組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與膠原蛋白海綿組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

對照組 5 744±411 396±162 1 080±460 1 440±560膠原蛋白海綿組 5 358±143△ 128±74△△ 596±183△ 448±68△△鼠尾膠原海綿組 5 318±115△ 112±99△△ 342±122△△＊ 204±311△△＊＊

耳緣靜脈和耳緣動脈出血創(chuàng)面上分別用鼠尾膠原蛋白海綿和膠原蛋白海綿壓敷止血10 min、60 min、6 h、12 h、24 h、48 h 均未觀察到止血材料脫落和再出血的現(xiàn)象。肝臟出血創(chuàng)面在用鼠尾膠原蛋白海綿壓敷止血后60 min觀察期內均末見再出血和滲血現(xiàn)象，鼠尾膠原蛋白海綿和膠原蛋白海綿與創(chuàng)面黏附良好。止血材料與凝血塊在創(chuàng)面上因為血液吸收和凝固形成完整覆蓋物，未見滲血現(xiàn)象。對兔肝臟止血后7 d，鼠尾膠原海綿組和膠原蛋白海綿組均觀察到創(chuàng)面局部的止血覆蓋物已形成機化瘢痕組織并有膜組織與其粘連。15 d后可見鼠尾膠原蛋白海綿止血材料部分被吸收;30 d后創(chuàng)面局部形成纖維組織，止血材料被全部吸收。膠原蛋白海綿組情況與鼠尾膠原海綿組基本相似，但30 d后創(chuàng)面局部形成纖維組織比鼠尾膠原海綿組大。

3 討論

本研究比較了膠原蛋白和鼠尾膠原蛋白海綿在止血方面的差異，通過對新西蘭兔耳緣靜脈、動脈、肝臟及股動脈創(chuàng)面止血效果的比較，進一步證明，鼠尾膠原有黏附創(chuàng)面性能好、創(chuàng)面干燥、不易發(fā)生感染、愈合迅速等特點［11］，在體內出血尤其是臟器表面止血發(fā)揮著重要的作用，而且其降解產物在較短時間內可被機體吸收;同時，在壓敷肝臟和股動脈等出血時，鼠尾膠原蛋白海綿比膠原蛋白海綿有著更優(yōu)異的止血性能。

膠原蛋白在自然狀態(tài)下止血效果最好，不需要進行交聯(lián)或變性成明膠，止血效率高，不良反應少，是一種理想的止血材料［12］。鼠尾膠原蛋白不僅能誘導血小板附著，產生釋放反應，還能激活凝血因子，黏著在滲血的傷口上，對損傷的血管起填塞作用，其纖維狀蛋白質與血液凝固中的纖維蛋白原比較接近，在體外單體可排列成纖維狀結構，這種結構有利于血細胞黏附在上面形成血栓凝塊，止血效率高，不良反應小，是一種理想的止血材料。這可能是因為鼠尾膠原蛋白主要為Ⅰ型膠原，存在真皮層且最普遍的以纖維形式形成膠原，由3股纏繞形成多肽鏈組，其結構和抗原性方面與人體組織的Ⅰ型膠原基本相同，具有低免疫源性、細胞適應性和細胞增殖作用、組織相容性、生物降解性等特性［13］。Ⅰ型膠原本身就是一種促進細胞貼壁生長的絕好材料，它具有引導上皮細胞遷入缺損區(qū)［14］，并在細胞遷移時起支持和潤滑作用。因此，鼠尾膠原及其凍干海綿可以作為人工皮膚及創(chuàng)傷敷料研究的首選材料。本研究論證了鼠尾膠原是一種與人體生物相容性好、具有降解性、止血速度快、傷口恢復好并具有修復功能的新型醫(yī)用止血材料，也為鼠尾膠原蛋白海綿用于止血、創(chuàng)面修復，并進一步研究其止血機制提供了事實依據(jù)。

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