夏金蘭 ，寧進(jìn)軍，陳程浩，萬民熙，聶珍媛

(1.中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院 湖南 長沙，410083；2.中南大學(xué) 生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙，410083)

生物柴油是替代化石燃料最有潛力的清潔能源，能有效減少化石燃料造成的溫室氣體排放[1?2]，是應(yīng)對(duì)全球能源危機(jī)的有效手段[3]。作為第三代生物能源，微藻生物柴油在許多方面具有和化石燃料相當(dāng)?shù)膬?yōu)良特性，其粘度、密度、閃點(diǎn)、濁點(diǎn)、流動(dòng)點(diǎn)和銅條腐蝕測試結(jié)果 6項(xiàng)指標(biāo)全部符合 EN14214以及ASTM6571標(biāo)準(zhǔn)[4]。微藻的養(yǎng)殖范圍很廣，甚至能在污水和鹽湖中生長[5]，不與農(nóng)作物爭奪有限耕地[6]。微藻生物柴油的制取過程分為養(yǎng)殖、采收、油脂提取和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，由于生產(chǎn)成本過高，目前被認(rèn)為尚無法大范圍工業(yè)應(yīng)用[7]。為了解決這個(gè)難題，研究者試圖將微藻生物柴油技術(shù)與市政污水處理[8]、厭氧消化制取沼氣[9]、煙道氣CO2固定耦聯(lián)，從而增加這項(xiàng)技術(shù)的經(jīng)濟(jì)可行性?；鹆Πl(fā)電廠、水泥廠、冶金廠煙道氣中含有大量的CO2氣體，直接排放會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的溫室效應(yīng)。哥本哈根會(huì)議嚴(yán)格規(guī)定了各國承擔(dān)的減排義務(wù)?！肚鍧嵃l(fā)展機(jī)制(CDM)的實(shí)施與管理》規(guī)定了項(xiàng)目級(jí)的碳減排量抵消額的轉(zhuǎn)讓與獲得，企業(yè)參與碳減排，可以獲得實(shí)實(shí)在在的經(jīng)濟(jì)收益。利用煙道氣中的高濃度CO2培養(yǎng)微藻，能夠顯著提高微藻細(xì)胞的生長速度、細(xì)胞濃度和油脂含量[7?8]，從而降低微藻生物柴油的成本。煙道氣含有硫氧化物、氮氧化物、粉塵及高熱，這些因素使微藻細(xì)胞的生長受到抑制。能耐受一定的高溫環(huán)境的微藻藻株，對(duì)生物柴油的制取以及煙道氣CO2的固定是至關(guān)重要的。紫外誘變技術(shù)以其簡便快捷和效果顯著，備受誘變育種研究者的青睞。配合原生質(zhì)體誘變技術(shù)[10]，增加了細(xì)胞對(duì)輻射的敏感程度，使紫外誘變的效果更佳。近年來利用紫外誘變這一經(jīng)典手段對(duì)微藻改性的研究很多，如降低對(duì) O2的敏感度[11]、增大對(duì) CO2的耐受性[12]、獲得耐高溫性質(zhì)[13]等。本研究從內(nèi)蒙古篩選得到的 1株淡水小球藻Chlorella sorokinianaCS-01[14]為出發(fā)藻株，采用原生質(zhì)體?紫外線誘變技術(shù)，高溫(55 ℃)環(huán)境培養(yǎng)為選擇壓力，獲得1株在該溫度下存活的突變?cè)逯?。通入模擬的500 MW火電廠煙道氣培養(yǎng)，評(píng)價(jià)該突變的藻株的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

淡水小球藻Chlorella sorokinianaCS-01(專利號(hào)200910252395.3)，為本實(shí)驗(yàn)室自行篩選得到的藻株，該藻株的特點(diǎn)是能高效利用高濃度CO2[15]。采用BG11作為培養(yǎng)基。

1.1.2 微藻細(xì)胞壁破除復(fù)合酶溶液

微藻細(xì)胞壁破除復(fù)合酶溶液中含2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)纖維素酶，0.5%半纖維素酶，1.5%離析酶，0.6 mol/L滲透壓調(diào)節(jié)劑，pH=6.0。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SPX-250B-G 微電腦光照培養(yǎng)箱，Sunrise Remote/Touch Screen 酶標(biāo)儀，紫外定時(shí)誘變儀，Beckman avanti j-E 離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)基單個(gè)成分按照1 000倍濃度配成工作母液，分開存儲(chǔ)。培養(yǎng)時(shí)，按1 mL/L添加母液至蒸餾水中，高壓滅菌；其中CaCl2和A5土壤營養(yǎng)液分開滅菌，并在超凈工作臺(tái)中添加，以免高溫環(huán)境使A5土壤營養(yǎng)液成分失活，鈣離子沉淀。取對(duì)數(shù)生長期的微藻，接種量為6.5×105個(gè)/mL，溫度為25 ℃，通氣量為0.05(kPa·m3)/h，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光暗比為14:10，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞濃度測定

每天取樣，樣品添加至96孔酶標(biāo)板，用分光光度計(jì)，700 nm波長下測量光密度(OD)值。每次測OD值之前，先測空白標(biāo)板的吸光值，相減得到樣品的吸光度。利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)已知OD值的樣品計(jì)數(shù)，建立細(xì)胞濃度對(duì) OD值的函數(shù)關(guān)系，為Y=(5.159X+0.008 4)×107個(gè)/mL，其中(Y為細(xì)胞濃度，X為OD值，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2)。

1.2.3 紫外誘變育種

小球藻細(xì)胞外包被了一層厚厚的細(xì)胞壁，對(duì)紫外線有很強(qiáng)的阻礙作用。利用復(fù)合酶溶液去除細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體[16]，對(duì)紫外線輻射更為敏感。實(shí)驗(yàn)方法見文獻(xiàn)[16]。

將制好的原生質(zhì)體平鋪于滅菌的培養(yǎng)皿，迅速放入紫外定時(shí)誘變儀，15 W紫外燈，30 cm，分別設(shè)置0，1，2，4，6，8，10，15，20，30 min 輻照時(shí)間，3個(gè)平行組。藻液放置黑箱過夜后，稀釋至合適濃度，涂平板，計(jì)算致死率。選擇合適的誘變時(shí)間，對(duì)Chlorella sorokinianaCS-01進(jìn)行誘變。紫外處理之前去除細(xì)胞壁。經(jīng)紫外處理的原生質(zhì)體黑箱過夜后，細(xì)胞壁再生，涂平板，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度為55℃，光照強(qiáng)度為5 000 lx，光暗比為14:10。

1.2.4 突變?cè)逯甑哪透邷匦再|(zhì)研究

將在高溫環(huán)境下存活的突變?cè)逯?，轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)(5 L光反應(yīng)器，光照強(qiáng)度為5 000 lx，通氣量為0.05(kPa·m3)/h，接種量為 6.2×105個(gè)/mL)。分別設(shè)置 15，25，35，45和55 ℃，3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。在相同的條件下，以出發(fā)藻株為對(duì)照組，研究該突變?cè)逯暝诓煌瑴囟认碌纳L速率、生物量以及油脂含量的變化情況。按已優(yōu)化的Bligh-Dyer法測定微藻的總脂含量[17]。

1.2.5 通入模擬火電廠煙道氣擴(kuò)大培養(yǎng)

擴(kuò)大培養(yǎng)突變?cè)逯辏? L光反應(yīng)器，接種量為6.3×105個(gè)/mL，溫度為38 ℃，光暗比為10:14，光照強(qiáng)度為5 000 lx，通氣量為0.05 (kPa·m3)/h(將裝機(jī)容量500 MW的火力發(fā)電廠煙道氣的模擬氣體，通入突變?cè)逯甑呐囵B(yǎng)液中)。由于煙道氣中的硫氧化物會(huì)造成酸雨，危害很大，因此，煙道氣排放之前都有除硫工序。模擬氣體成分不含SO2。

1.2.6 突變?cè)逯甑倪z傳穩(wěn)定性研究

活化突變?cè)逯?，取第二代為M1，連續(xù)傳代5次，保持每一代培養(yǎng)條件(5 L光反應(yīng)器，接種量為6.3×105個(gè)/mL，溫度為40 ℃，光暗比為10:14，光照強(qiáng)度5 000 lx，通氣量為 0.05 (kPa·m3)/h)相同，每日測定細(xì)胞濃度，繪制藻株的生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變條件的確定

去除細(xì)胞壁的微藻原生質(zhì)體，對(duì)紫外線非常敏感，處理5 min時(shí)超過50%細(xì)胞死亡，15 min時(shí)致死率達(dá)到 100%。紫外線誘變育種方法對(duì)于有細(xì)胞壁包被的細(xì)胞難以奏效的原因是細(xì)胞壁降低了細(xì)胞對(duì)輻射的敏感度，盡管該方法簡單易行，卻效果不佳。紫外誘變育種研究中，多選擇致死率99%以上的誘變劑量，以便減小篩選的工作量，同時(shí)確保較大的突變率，但是，存在誘變劑量過高、菌體死亡的問題。本研究由于采用的篩選壓力十分有效，不需要花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行篩選，因此，可以使用相對(duì)較小的劑量來進(jìn)行誘變，處理8 min，致死率為81%左右，能保證輻射劑量足夠，引起突變數(shù)量較多。

圖1 不同劑量紫外線對(duì)小球藻Chlorella sorokiniana CS-01的致死情況Fig.1 Lethality of Chlorella sorokiniana CS-01 under different dosages of UV

2.2 突變?cè)逯昙?xì)胞形態(tài)的變化

經(jīng)纖維素復(fù)合酶溶液破壁后的小球藻細(xì)胞，由紫外線處理8 min后，在黑箱過夜，細(xì)胞壁再生。通過顯微鏡觀察，耐高溫的小球藻突變?cè)逯?，?xì)胞形態(tài)較出發(fā)藻株Chlorella sorokinianaCS-01，并未發(fā)生改變。紫外線輻射改變了藻細(xì)胞的DNA，造成酶的改變，激活了與耐受高溫相關(guān)的酶的合成與表達(dá)，但是并未引起細(xì)胞形態(tài)的改變。

圖2 出發(fā)藻株和突變?cè)逯暝陲@微鏡下的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Cell morphologies of Chlorella sorokiniana CS-01 and mutated alga under microscope

2.3 突變?cè)逯昴褪芨邷氐男再|(zhì)

Chlorella sorokinianaCS-01是從內(nèi)蒙古選育得到的 1株淡水小球藻，生長速度快，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，特別是該藻株能夠耐受高濃度 CO2，具有應(yīng)用于工業(yè)煙道氣固定CO2的潛力。該藻株為常溫養(yǎng)殖，最適生長溫度為25～30 ℃，超過40 ℃時(shí)基本上不能生長。工業(yè)煙道氣含高熱，而為了縮短改造工序，對(duì)煙道的改造一般不設(shè)置專門的冷卻裝置，從而會(huì)引起微藻養(yǎng)殖池的溫度大幅度提高。有人利用煙道氣進(jìn)行溫水水產(chǎn)養(yǎng)殖[18]，高溫實(shí)際上會(huì)讓生長活動(dòng)加速，生產(chǎn)周期降低。

經(jīng)誘變處理的微藻細(xì)胞，放置于 55 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，得到1株存活的藻株。經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后平板再次純化。以出發(fā)藻株為對(duì)照，研究不同溫度下藻株的生長曲線、生物質(zhì)產(chǎn)量和油脂含量，結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出：低溫培養(yǎng)時(shí)，二者的生長都很緩慢，細(xì)胞濃度低；高溫培養(yǎng)時(shí)，突變?cè)逯甑膬?yōu)勢(shì)越發(fā)明顯：35 ℃是突變?cè)逯贻^合適的培養(yǎng)溫度，穩(wěn)定期的細(xì)胞濃度達(dá)到2.08×108個(gè)/mL，而對(duì)照組的小球藻生長情況已經(jīng)接近低溫(15 ℃)培養(yǎng)時(shí)的狀態(tài)，細(xì)胞濃度很低。圖3(f)所示為40 ℃之后的情形，對(duì)照組的原始小球藻已經(jīng)沒有生長跡象，培養(yǎng)液發(fā)白，而突變?cè)逯暝?0 ℃時(shí)仍然具有相當(dāng)高的生長活性，進(jìn)一步表明該突變?cè)逯暝?0～40 ℃范圍內(nèi)生長都很旺盛；高于40 ℃時(shí)，生長受到抑制，但在55 ℃仍能維持基本生長。這在淡水小球藻中是非常罕見的。溫水養(yǎng)殖技術(shù)，利用的是廢熱，水溫設(shè)置一般為18～34 ℃[19]?；痣姀S煙道氣將導(dǎo)致溫度更大幅度提升，會(huì)達(dá)到40 ℃左右，在開放池培養(yǎng)體系中，一般不超過45 ℃。突變的小球藻藻株耐高溫的性質(zhì)基本能滿足煙道氣溫水養(yǎng)殖的需求。

圖3 不同溫度培養(yǎng)下出發(fā)藻株和突變?cè)逯甑纳L曲線Fig.3 Growth curves of Chlorella sorokiniana CS-01 and mutated alga cultured at different temperatures

生物質(zhì)產(chǎn)量也有相同的規(guī)律。圖4描述了出發(fā)藻株和突變?cè)逯暝诓煌瑴囟扰囵B(yǎng)下5 L藻液的生物質(zhì)產(chǎn)量，比較了突變?cè)逯旰驮嫉脑逯甑姆€(wěn)定期藻粉濕質(zhì)量和干質(zhì)量。從圖4可見：在25 ℃左右，二者的產(chǎn)量基本一致，這再次證明了突變?cè)逯暝诘蜏貢r(shí)與原始藻株的一致性。超過30 ℃時(shí)，出發(fā)的原始藻株的生物質(zhì)產(chǎn)量開始略微下降，與此不同的是，突變株的生物質(zhì)產(chǎn)量大幅度增加，這正是由于2種細(xì)胞對(duì)高溫不同的耐受性。突變株由于能抵抗高溫對(duì)細(xì)胞的抑制，與新陳代謝相關(guān)的酶在30～35 ℃下活性更高，生命活動(dòng)更加旺盛，在同樣的時(shí)間內(nèi)，累積的生物質(zhì)相應(yīng)更多。從圖4還可計(jì)算出：經(jīng)4 000 r/min離心的濕藻中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為60%。

圖4 不同溫度培養(yǎng)出發(fā)藻株和突變?cè)逯甑纳镔|(zhì)產(chǎn)量Fig.4 Biomass yields of Chlorella sorokiniana CS-01 and mutated alga cultured at different temperatures

表 1所示為突變?cè)逯昱c原始出發(fā)藻株的油脂含量對(duì)比。經(jīng)過紫外輻射作用之后，突變?cè)逯甑挠椭柯晕⒔档?，可能是旺盛的生長與脂質(zhì)累積是相沖突的。值得注意的是，突變?cè)逯甑钠骄椭|(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，在淡水小球藻中屬于中上水平，加之它相當(dāng)高的生長速度以及生物質(zhì)產(chǎn)量，其最終的油脂產(chǎn)量仍然是很高。這對(duì)于工業(yè)應(yīng)用十分重要。

表1 出發(fā)藻株(A)和突變?cè)逯?B)不同溫度培養(yǎng)下油脂含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Table 1 Oil content of Chlorella sorokiniana CS-01(A) and mutated alga(B) cultured at different temperatures %

2.4 突變?cè)逯甑倪z傳穩(wěn)定性

由于獲得突變株經(jīng)過幾次傳代之后，優(yōu)良性狀難以繼續(xù)維持，出現(xiàn)退化，因此，在評(píng)價(jià)一個(gè)突變體性質(zhì)時(shí)，其遺傳穩(wěn)定性是一個(gè)必須要考察的指標(biāo)。圖 5所示為突變株連續(xù)接種5代，在38 ℃、其他培養(yǎng)條件均嚴(yán)格保持一致的條件下，各代的生長情況。圖中標(biāo)識(shí)為M1的實(shí)際為該突變株的第3代。由于經(jīng)過了多次轉(zhuǎn)接和平板活化，此時(shí)藻株的生長活力是最強(qiáng)的。在該溫度下，各代的生長都很旺盛，很好地繼承了耐高溫的性質(zhì)；生長情形相似，細(xì)胞濃度很大，呈現(xiàn)墨綠色。穩(wěn)定期細(xì)胞濃度高達(dá)1.3×108/mL。

圖5 突變?cè)逯甑倪z傳穩(wěn)定性Fig.5 Genetic stability of mutated alga

2.5 模擬煙道氣擴(kuò)大培養(yǎng)

參照湖南長沙附近的火電廠(華電集團(tuán)長沙電廠)，模擬煙道氣企業(yè)裝機(jī)容量為500 MW，煙氣中除了不含有硫氧化物(工廠均有除硫裝置，煙氣中含硫量很小)，其余氣體成分按比例混合配制。

表2 裝機(jī)容量500 MW的火力發(fā)電廠煙道氣成分Table 2 Flue gas components of 500 MW thermal power plant

將煙氣通入培養(yǎng)微藻的開放池，勢(shì)必造成水溫過高。用溫控型光照培養(yǎng)箱直接設(shè)置38 ℃，通入模擬氣體培養(yǎng)，結(jié)果見圖6。圖6表明：模擬氣體的通入頭3 d，微藻細(xì)胞處于適應(yīng)過程，細(xì)胞無增殖現(xiàn)象；第 4天進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，第7天就達(dá)到生長頂峰，細(xì)胞濃度達(dá) 1.3×108/mL。煙道氣中高濃度的 CO2氣體有效地促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長，生長周期縮短2 d。

圖6 通入模擬煙道氣培養(yǎng)突變?cè)逯甑纳L曲線Fig.6 Growth curve of the mutated alga cultured under pumping of simulated flue gas

5 L藻液離心收集后冷凍干燥，得到4.4 g干藻粉，提取得到1.8 g油脂，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)40.7%，與出發(fā)藻株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比提高近1倍。高濃度的CO2顯然對(duì)突變?cè)逯甑纳L、油脂累積同樣起到了積極的作用。生長周期縮短對(duì)工業(yè)生產(chǎn)意義重大，這能大幅度消減成本。油脂含量的提高同樣可以增加單位油脂產(chǎn)量。只要生產(chǎn)成本降低到可接受的程度，這項(xiàng)最有前景的清潔能源計(jì)劃將能付諸實(shí)施。

本研究將瞄準(zhǔn)工業(yè)煙道氣CO2固定，以獲得耐高溫藻株為目標(biāo)。若期望獲得油脂含量高的突變?cè)逯?，只需在本研究的基礎(chǔ)上，對(duì)篩選環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)即可。在原生質(zhì)體?紫外誘變處理之后，結(jié)合尼羅紅細(xì)胞染色技術(shù)，用熒光顯微鏡觀測，細(xì)胞內(nèi)的油脂成分與尼羅紅染料特異結(jié)合，產(chǎn)物能激發(fā)熒光，熒光強(qiáng)度能線性表征油脂含量。尼羅紅染色解決了評(píng)價(jià)藻細(xì)胞油脂含量的技術(shù)難題，適合大量多批次的重復(fù)性研究。

3 結(jié)論

(1) 本研究采用原生質(zhì)體?紫外線誘變技術(shù)進(jìn)行育種，效果良好，細(xì)胞壁的去除極大增大了細(xì)胞對(duì)紫外輻射的敏感程度。

(2) 獲得 1株遺傳穩(wěn)定的耐高溫的淡水小球藻，并且在較高溫度有較好的生理生化表現(xiàn)，適合作為煙道氣 CO2固定以及微藻生物柴油生產(chǎn)的工業(yè)應(yīng)用藻種。

(3) 模擬500 MW火電廠煙道氣成分?jǐn)U大培養(yǎng)該突變?cè)逯?，?duì)煙道氣中有毒成分適應(yīng)之后，高濃度CO2使生長周期縮短2 d，油脂含量提高近1倍。突變?cè)逯戢@得耐高溫的性質(zhì)的同時(shí)，未丟失原始藻株對(duì)高濃度CO2的耐受能力。

(4) 該突變微藻對(duì)煙道氣 CO2的固定效率有待進(jìn)一步進(jìn)行研究，這對(duì)于工業(yè)應(yīng)用是至關(guān)重要的。

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