于梟燕，陳 丹，邢向遠(yuǎn)，趙國(guó)群，3，王 勇＊

（1.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.阿爾格河北生命科學(xué)有限公司，河北 辛集052360；3. 河北省發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050000）

蛋白核小球藻作為一種單細(xì)胞綠藻，又被簡(jiǎn)稱為小球藻[1]。在農(nóng)業(yè)上，因其可以改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況，對(duì)作物果實(shí)提質(zhì)增產(chǎn)，促進(jìn)植物種子發(fā)芽[2]，小球藻作為綠色化生物肥料受到廣泛關(guān)注。此外，因小球藻可以吸附并排除毒素，可以抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖。盡管小球藻的應(yīng)用前景廣闊，目前，小球藻培養(yǎng)仍存在著培養(yǎng)周期長(zhǎng)、藻體密度低的技術(shù)瓶頸，這進(jìn)一步提高了生產(chǎn)成本，限制了藻體的高效規(guī)模化生產(chǎn)。

本研究聚焦于蛋白核小球藻的培養(yǎng)工藝優(yōu)化，分析了培養(yǎng)基構(gòu)成、培養(yǎng)體系的裝液量和接種量、培養(yǎng)基初始pH 等因素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的作用影響，進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)工藝，為小球藻的高效規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻株與培養(yǎng)基

蛋白核小球藻，由阿爾格河北生命科學(xué)有限公司提供。

藻體培養(yǎng)采用BG-11 培養(yǎng)基[3]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖（分析純）購(gòu)自天津市百世化工有限公司，乙二胺四乙酸二鈉（分析純）購(gòu)自天津歐博凱化工有限公司，IAA（分析純）購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，其它試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小球藻種子液的制備

將BG-11 培養(yǎng)基裝入250 mL 三角瓶?jī)?nèi)（裝液量100 mL），滅菌條件為121 ℃，保溫20 min。將適量蛋白核小球藻斜面培養(yǎng)物接入三角瓶，培養(yǎng)條件為28℃，光照強(qiáng)度2400 Lux，搖床轉(zhuǎn)速140 rpm。

1.2.2 小球藻培養(yǎng)條件

取小球藻種子液轉(zhuǎn)接入滅菌后的BG-11 培養(yǎng)基，接種率為10%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為光照2400 Lux，光暗比24∶0，搖床轉(zhuǎn)速140 rpm，溫度28 ℃。

1.2.3 碳源對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

碳源分別采用等摩爾氮濃度（0.19 mmol/L）的葡萄糖、乙酸鈉、NaHCO3、Na2CO3。進(jìn)一步采用濃度梯度為1.0～10.0 g/L 的葡萄糖，以確定葡萄糖濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。光照培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

1.2.4 氮源對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

在葡萄糖濃度為7.0 g/L 條件下，氮源分別采用等摩爾氮濃度（17.6 mmol/L） 的NH4H2PO4、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素和NaNO3。進(jìn)一步采用濃度梯度為0.3～3.0 g/L 的尿素，以確定尿素濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。光照培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

1.2.5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

在7.0 g/L 葡萄糖和1.5 g/L 尿素條件下，采用濃度梯度為25.0～100.0 mg/L 的K2HPO4，光照培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

在7.0 g/L 葡萄糖、1.5 g/L 尿素和0.075 g/L K2HPO4條件下，采用濃度梯度為35.0～1 000.0 mg/L的MgSO4，光照培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

1.2.6 植物激素和維生素對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

在優(yōu)化后培養(yǎng)基中分別添加濃度梯度為0.0～10.0 mg/L 的IAA；分別添加濃度梯度為0.0～100.0 μg/L的維生素B12；分別添加濃度梯度為0.0～1000.0 μg/L的生物素；光照培養(yǎng)7 d，以確定IAA、維生素B12及生物素對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。

1.2.7 接種量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

當(dāng)培養(yǎng)基組成為7.0 g/L 葡萄糖，1.5 g/L 尿素，0.075 g/LK2HPO4，0.15 g/LMgSO4，1.0 mg/LIAA，10 μg/L維生素B12和100 μg/L 生物素，其他成分不變時(shí)，采用接種量梯度為5～20%，光照培養(yǎng)7 d，以確定接種量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。

1.2.8 培養(yǎng)基初始pH 與初始裝液量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

當(dāng)培養(yǎng)基組成為7.0 g/L 葡萄糖，1.5 g/L 尿素，0.075 g/L K2HPO4，0.15 g/L MgSO4，1.0 mg/L IAA，10 μg/L 維生素B12和100 μg/L 生物素，其他成分不變時(shí)，采用培養(yǎng)基初始pH 梯度為6.0～10.0，250 mL 三角瓶裝液量梯度為80～140 mL，光照培養(yǎng)7 d，以確定培養(yǎng)基初始pH 和裝液量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。

1.2.9 蛋白核小球藻培養(yǎng)條件優(yōu)化

基于接種量、培養(yǎng)基初始pH 及初始裝液量，開(kāi)展3 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.10 分析方法

小球藻的生長(zhǎng)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。將待測(cè)藻液搖勻，取8 μL 適當(dāng)稀釋后藻液沿蓋玻片邊緣緩慢充滿計(jì)數(shù)室。靜置5 min，放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

如圖1（a）所示，當(dāng)采用葡萄糖和乙酸鈉時(shí)，藻細(xì)胞密度分別達(dá)到了2.71×106和2.09×106個(gè)/mL。本研究結(jié)果與劉茜等[4]在碳源優(yōu)化分析中所得結(jié)果一致。如圖1（b）所示，當(dāng)將葡萄糖濃度從1.0 g/L 增加到7.0 g/L，藻細(xì)胞密度從2.9×106個(gè)/mL 提升到6.75×106個(gè)/mL。過(guò)高濃度的葡萄糖可能會(huì)對(duì)小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

2.2 氮源對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

在采用不同氮源條件下（圖1（a）），尿素對(duì)小球藻生長(zhǎng)促進(jìn)最明顯，藻細(xì)胞密度達(dá)到了6.96×106個(gè)/mL。在無(wú)機(jī)氮源中，NaNO3為氮源時(shí)，小球藻細(xì)胞密度為6.48×106個(gè)/mL，略低于尿素條件。尿素作為小球藻的最適氮源這一結(jié)論也被葛珍珍等[5]研究報(bào)道。因此，本研究采用氮源為尿素。如圖1（b）所示，當(dāng)尿素濃度由0.3 g/L 提升到1.5 g/L 時(shí)，小球藻細(xì)胞濃度逐漸增高，當(dāng)尿素濃度為1.5 g/L 時(shí)，藻細(xì)胞密度達(dá)到7.33×106個(gè)/mL，比不添加尿素的對(duì)照組提高了34%。當(dāng)尿素濃度超過(guò)1.5 g/L 時(shí)，小球藻生物量有所下降。因此，小球藻的最適尿素濃度為1.5 g/L。

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

磷通過(guò)作用于小球藻細(xì)胞膜、核酸、葉綠素等的合成對(duì)小球藻的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)生影響[6]。如圖2 所示，當(dāng)磷源濃度為75.0 mg/L 時(shí)，藻細(xì)胞密度最高，為7.43×106個(gè)/mL，比對(duì)照組提高了11.2%。但是當(dāng)磷源濃度達(dá)到100.0 mg/L 時(shí)，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)受到一定抑制，藻細(xì)胞密度略有下降。已有研究表明，當(dāng)磷源濃度低于70.0 mg/L，小球藻的生長(zhǎng)速率和生物量與磷源含量呈正相關(guān)，且最適磷源濃度為70.0 mg/L[7]。本研究中小球藻最適磷濃度采用75.0 mg/L。

圖2 磷酸氫二鉀和硫酸鎂對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

鎂作為葉綠素和某些輔酶的主要構(gòu)成成分，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有重要意義[8]。如圖2 所示，當(dāng)MgSO4濃度在0～150 mg/L，小球藻細(xì)胞密度隨MgSO4濃度的增加而增加，小球藻最大藻體密度為7.88×106個(gè)/mL，比對(duì)照組提高了15.9%。當(dāng)硫酸鎂濃度超過(guò)150 mg/L 時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。本研究中小球藻的最適MgSO4濃度為150 mg/L。

2.4 植物激素和維生素對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

2.4.1 IAA 對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

IAA 濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響如圖3 所示，當(dāng)IAA 濃度在0.05 mg/L～10 mg/L 時(shí)，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。當(dāng)IAA 濃度低于1.0 mg/L 時(shí)，小球藻的細(xì)胞密度隨著IAA 濃度的增加而增大，當(dāng)IAA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)，小球藻細(xì)胞密度最高達(dá)8.13×106個(gè)/mL，為對(duì)照組的1.07 倍。然而，當(dāng)IAA 濃度大于1.0 mg/L 時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)受到一定抑制。本研究確定最適IAA 濃度為1.0 mg/L。

圖3 IAA、維生素B12 和維生素B7 對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

2.4.2 維生素B12對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

王士倫等[9]發(fā)現(xiàn)添加適量的維生素B12能夠促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)和葉綠素含量的提升。由圖3 可知，在維生素B12濃度為0～10 μg/L 時(shí)，蛋白核小球藻生物量隨著維生素B12濃度的增大而增加，小球藻細(xì)胞密度最高為9.73×106個(gè)/mL，比對(duì)照組提高了12%。當(dāng)維生素B12濃度大于10 μg/L 時(shí)，其對(duì)小球藻的促進(jìn)效果有所下降。本研究確定維生素B12最適添加量為10 μg/L。

2.4.3 生物素對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

生物素（也稱為Vitamin H 或B7）作為輔因子對(duì)生理代謝產(chǎn)生重要意義[10]。由圖3 可知，在生物素濃度為低于100 μg/L 時(shí)，蛋白核小球藻的生物量隨著生物素濃度的增加而增大，蛋白核小球藻的生物量最高為1.08×107個(gè)/mL，比對(duì)照組提高了15.6%。當(dāng)生物素濃度超過(guò)100 μg/L 時(shí)，小球藻的生物長(zhǎng)受抑制。本研究中生物素的最適添加量為100 μg/L。

2.5 接種量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

由圖4 可知，當(dāng)小球藻的接種量為5%時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生物量較其他接種組低。當(dāng)接種量為10%時(shí)，小球藻的生物量最高，為1.04×107個(gè)/mL，比5%接種量組提高了14.7%。當(dāng)接種量大于10%，小球藻的生物量隨接種量增大而逐漸降低。本研究中小球藻培養(yǎng)的最適接種量為10%。

圖4 接種量、培養(yǎng)基初始pH 及裝液量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

2.6 培養(yǎng)基初始pH 及初始裝液量對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

如圖4 所示，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 為7 時(shí)，小球藻生物量最高，為1.05×107個(gè)/mL。當(dāng)pH 達(dá)到10 時(shí)，小球藻的生物量最低，較pH7 處理組下降了28.3%。隨著裝液量的增大，小球藻的細(xì)胞密度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)裝液量為100 mL 時(shí)，藻細(xì)胞密度達(dá)1.1×107個(gè)/mL。顯然，裝液量過(guò)大會(huì)造成限制氣體傳質(zhì)，裝液量過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致底物濃度受限。

2.7 蛋白核小球藻的培養(yǎng)條件優(yōu)化

在以上基礎(chǔ)上，采用葡萄糖7.0 g/L、尿素1.5 g/L、K2HPO475 mg/L 及MgSO4150 mg/L，進(jìn)行3 因素3 水平的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（表2）。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3 可知，培養(yǎng)基初始pH 和接種量對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞密度影響顯著。最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種量10%，培養(yǎng)基初始pH8，裝液量100 mL。最優(yōu)條件下，蛋白核小球藻的生物量為1.16×107個(gè)/mL。

表3 方差分析表

2.8 小球藻在優(yōu)化條件下的生長(zhǎng)曲線

將小球藻的種子液接種至優(yōu)化培養(yǎng)基中，在優(yōu)化培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（圖5）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為10d時(shí)，小球藻的藻細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值為1.37×107個(gè)/mL。培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)10d 后，小球藻細(xì)胞密度達(dá)到穩(wěn)定。魏東等[11]發(fā)現(xiàn)小球藻培養(yǎng)10 天后生長(zhǎng)基本穩(wěn)定，與本研究結(jié)果一致。因此，本研究中小球藻在優(yōu)化條件下發(fā)酵周期為10d。

圖5 小球藻在優(yōu)化條件下的生長(zhǎng)曲線

3 結(jié)論

本研究確定了蛋白核小球藻培養(yǎng)的最適碳氮源及濃度，闡明了無(wú)機(jī)鹽、植物激素和微生素對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。在優(yōu)化培養(yǎng)基構(gòu)成為葡萄糖7.0 g/L、尿素1.5 g/L、K2HPO475 mg/L、MgSO4150 mg/L，IAA 1 mg/L、維生素B1210 μg/L 和生物素100 μg/L 條件下，小球藻生物量達(dá)到1.08×107個(gè)/mL。確定了最佳培養(yǎng)條件為接種量10%，培養(yǎng)基初始pH8，裝液量100 mL。最佳條件下，蛋白核小球藻的生物量達(dá)到1.16×107個(gè)/mL，且在此條件下小球藻的發(fā)酵周期為10 d。