李海濤 ，吳沿友 ，付 兵

（1. 貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 551400；2. 中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所,環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550081）

0 引 言

微藻是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，是指一類(lèi)生活在水中，營(yíng)浮游生活方式的微小植物的總稱(chēng)。碳酸酐酶(Carbonic anhydrase, CA) (EC4.2.1.1)是一種含Zn 的金屬酶，它具有高效、專(zhuān)一地快速催化CO2和HCO3-之間的相互轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，在無(wú)CA 的條件下，CO2和HCO3-之間的平衡需要一分鐘；而在有CA 催化的條件下，CO2和HCO3-之間的平衡只需要10-6秒[1]。碳酸酐酶在促進(jìn)大氣CO2水合反應(yīng)進(jìn)入水體中具有重要作用，其次，碳酸酐酶在促進(jìn)碳酸鹽巖溶蝕，加速水生植物光合作用等方面都具有重要意義[2-7]。

巖溶碳匯是指以微藻為代表的水生生物吸收利用碳酸鹽巖溶蝕的以HCO3-為代表的無(wú)機(jī)碳的過(guò)程。巖溶湖泊水體的溶質(zhì)大多受流域的溶蝕作用的控制，水-巖-氣之間存在天然的相互轉(zhuǎn)化，且它們之間始終處于動(dòng)態(tài)平衡之中(CaCO3+CO2+H2O ?Ca2++HCO3-+CO32-+H+)，并最終影響氣候變化[3,5,8]。巖溶地區(qū)水體的pH 大多為弱堿性（pH 介于7.2～8.5之間），且具有廣泛的時(shí)空異質(zhì)性[2]。不同的pH 和HC濃度的巖溶水體環(huán)境，能夠顯著地影響水體微藻的種群結(jié)構(gòu)[9-10]。

巖溶湖泊微藻屬于自然狀態(tài)下的多種微藻的混合物。本研究區(qū)域的紅楓湖已發(fā)現(xiàn)微藻種類(lèi)有7門(mén)102 種（屬），具有明顯的種群多樣性[11]。從時(shí)間上看，微藻類(lèi)群具有典型的季節(jié)更替規(guī)律，春夏以綠藻為主、秋季開(kāi)始，硅藻開(kāi)始增加[5]；從空間上看，微藻存在地域的異質(zhì)性，張?zhí)盏萚4]發(fā)現(xiàn)廣西上林縣大龍洞巖溶水庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)微藻種類(lèi)有5 門(mén)17 屬 ，由于氣候、地質(zhì)背景和巖溶等共同作用所帶來(lái)的水環(huán)境差異，造成自然水體的微藻種群差異較大。總之，湖泊微藻也存在典型的季節(jié)性周期波動(dòng)和空間的異質(zhì)性。

巖溶流域自然水體常出現(xiàn)高濃度的重碳酸鹽和低濃度的溶解二氧化碳，這嚴(yán)重影響著以微藻為代表的水生浮游植物的生長(zhǎng)。微藻為應(yīng)對(duì)巖溶流域的水體環(huán)境，慢慢進(jìn)化出了通過(guò)碳酸酐酶來(lái)加快無(wú)機(jī)碳代謝過(guò)程的方法。不同微藻的碳酸酐酶的活力差異懸殊，碳酸酐酶胞外酶活性強(qiáng)的微藻能夠敏感捕捉進(jìn)入水體的大氣CO2，并快速被微藻的光合作用所利用（即光合碳匯）。而碳酸酐酶活性弱的微藻，在無(wú)機(jī)碳的轉(zhuǎn)化利用方面存在嚴(yán)重不足。由于不同微藻的碳酸酐酶活性差異較大，并由此帶來(lái)了不同種屬微藻生長(zhǎng)的巨大差異，進(jìn)而影響微藻的光合碳匯能力差異懸殊。

穩(wěn)定碳同位素組成分析 (δ13C)是一種區(qū)分不同無(wú)機(jī)碳來(lái)源的重要手段[12-14]。在無(wú)碳酸酐酶催化的條件下，微藻吸收利用重碳酸鹽（HCO3-）的過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大約10‰的穩(wěn)定碳同位素分餾[15]；然而，由碳酸酐酶胞外酶催化的碳酸氫根離子的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程只存在約1.1‰的碳同位素分餾[16]。結(jié)合已有研究獲知，在微藻吸收利用重碳酸鹽的過(guò)程中，因碳酸酐酶胞外酶的催化與否，兩者之間存在約9‰的穩(wěn)定碳同位素分餾差異[17]。因此，通過(guò)穩(wěn)定碳同位素技術(shù)來(lái)識(shí)別各種微藻碳酸酐酶胞外酶的差異具有可行性。

本研究通過(guò)向微藻培養(yǎng)液中添加不同濃度的碳酸酐酶胞外酶特異性抑制劑乙酰唑胺(Acetazolamide,AZ)，來(lái)模擬巖溶湖泊水體中碳酸酐酶胞外酶活性差異懸殊的各種微藻。通過(guò)向培養(yǎng)液中添加兩種δ13C差異較大的碳酸氫鈉來(lái)模擬巖溶地區(qū)自然水體中固有的（即碳酸鹽巖溶蝕產(chǎn)生的）HCO3-，利用雙同位素示蹤模型，區(qū)分出微藻利用水體中固有的HCO3-和利用大氣CO2兩種來(lái)源[18]，并結(jié)合微藻的生物量，分別定量計(jì)算微藻的巖溶碳匯和光合碳匯，來(lái)探討自然水體中的不同微藻對(duì)不同碳匯的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選擇西南巖溶區(qū)域-貴陽(yáng)市著名的紅楓湖（N26°26′- N26°35′，E106°19′- E106°28′）為研究對(duì)象，使用浮游生物網(wǎng)多點(diǎn)采集湖泊表層水體中的微藻樣品。打撈到的湖泊微藻盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，去除雜質(zhì)，作為實(shí)驗(yàn)處理的儲(chǔ)備藻種。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

微藻培養(yǎng)液采用改良的SE 液體培養(yǎng)基，通過(guò)添加少量NaOH 或HCl 調(diào)節(jié)滅菌后的各個(gè)處理液pH值都穩(wěn)定在8.0±0.1。培養(yǎng)條件如下：光照強(qiáng)度200 umol · m-2· s-1，光照12 h，溫度保持在22.0±1.0 ℃；夜間12 h，溫度保持18.0±1.0 ℃。碳酸氫鈉濃度設(shè)置參照紅楓湖水體中的可溶性無(wú)機(jī)碳(Dissolved Inorganic Carbon, DIC)含量，多年觀測(cè)普遍在1.6～2.7 mmol · L-1之間，本研究取多年觀測(cè)的平均值，設(shè)置為2.2 mmol · L-1，所添加的標(biāo)記的兩種碳酸氫鈉的δ13C 值分別為-17.4‰和-28.4‰，乙酰唑胺(Acetazolamide, AZ)濃 度 梯 度 設(shè) 置：0，0.5 mmol · L-1，1.0 mmol · L-1，2.0 mmol · L-1，10.0 mmol · L-1。

巖溶湖泊微藻新鮮儲(chǔ)備液經(jīng)充分混合均勻，并嚴(yán)格控制各個(gè)處理的初始微藻接種量，盡可能消除微藻濃度及種群的差異，以便精確探討AZ 濃度梯度實(shí)驗(yàn)處理對(duì)巖溶湖泊微藻穩(wěn)定碳同位素組成的影響。各個(gè)實(shí)驗(yàn)處理同時(shí)同批次平行培養(yǎng)6 瓶，培養(yǎng)周期為5 d。且在實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中，不斷隨機(jī)調(diào)換位置，以消除培養(yǎng)室局部的溫度、光照差異對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。

1.3 微藻蛋白質(zhì)含量的測(cè)定及生物量增殖倍數(shù)

微藻蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法[19]。為了更直觀地比較各個(gè)處理下的微藻增殖情況，本研究采用微藻蛋白質(zhì)含量的增殖倍數(shù)（M）的形式來(lái)表示微藻的生長(zhǎng)情況，具體如下：

式中：Ne為處理結(jié)束時(shí)的微藻蛋白質(zhì)含量；N0為處理開(kāi)始時(shí)的微藻蛋白質(zhì)含量。

1.4 穩(wěn)定碳同位素的測(cè)定

離心收集處理后的微藻樣品，加入適量1.0 mol · L-1鹽酸洗滌微藻，以去除微藻表面所攜帶的無(wú)機(jī)碳的影響，接下來(lái)用超純水多次洗滌、離心收集待測(cè)微藻，直至中性。最后，用冷凍干燥儀充分干燥待測(cè)微藻樣品。

穩(wěn)定碳同位素的測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)[20]，最后以δ13C（Pee Dee Belemnite, PDB）的形式表示。

1.5 微藻的巖溶碳匯和光合碳匯

本研究基于實(shí)驗(yàn)處理后的微藻穩(wěn)定碳同位素組成的信息，通過(guò)構(gòu)建雙同位素示蹤模型，計(jì)算出了微藻吸收利用培養(yǎng)液中添加的碳源份額fB[18]。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)處理前后，微藻的生物量增殖倍數(shù)M。分別計(jì)算出微藻的巖溶碳匯能力（CSk）和光合碳匯能力（CSp），具體如下：

式中：CSk為巖溶碳匯能力；CSp為光合碳匯能力；M為微藻生物量的增殖倍數(shù)；fB微藻吸收利用培養(yǎng)液中添加碳源的份額。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳酸酐酶胞外酶對(duì)微藻生物量的影響

如表1 所示，在添加碳酸酐酶胞外酶特異性抑制劑（AZ）處理下，受添加AZ 濃度增加影響，藻液的蛋白質(zhì)含量呈不斷下降的趨勢(shì)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)處理的微藻初始接種時(shí)的蛋白質(zhì)濃度都嚴(yán)格控制在0.50 mg · L-1附近，實(shí)驗(yàn)處理5 d，未添加AZ 處理的藻液蛋白質(zhì)濃度增長(zhǎng)到了3.07±0.15 mg · L-1，而添加10.0 mmol · L-1AZ 處理的微藻增長(zhǎng)緩慢，藻液蛋白質(zhì)濃度僅達(dá)到了1.05±0.37 mg · L-1，兩者之間差異顯著（n=3, P＜0.05）。由此可見(jiàn)，在微藻碳酸酐酶胞外酶活性強(qiáng)的條件下，能夠顯著促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)。隨著添加AZ 濃度的增加，微藻的碳酸酐酶胞外酶活性受到了越來(lái)越大的抑制。徐濤等[21]通過(guò)研究AZ 對(duì)萊氏衣藻光合放氧和生長(zhǎng)的影響，也得到了同樣的抑制效果。

表1 AZ 濃度梯度處理下的微藻碳同位素組成(‰, PDB)Table 1 δ13C value of the microalgae under different concentrations of AZ (‰, PDB)

本研究發(fā)現(xiàn)，以添加2.0 mmol · L-1AZ 的濃度處理為分界線，各個(gè)處理間的微藻蛋白質(zhì)含量達(dá)到了差異顯著（n=3, P＜0.05）?？傊砑覣Z，碳酸酐酶胞外酶受到了抑制，微藻的生長(zhǎng)受到了影響，隨著添加AZ 濃度的增加，其對(duì)微藻生長(zhǎng)影響帶來(lái)了顯著的差異，直至AZ 在培養(yǎng)液中達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)（10.0 mmol · L-1），AZ 對(duì)微藻碳酸酐酶胞外酶活性的抑制能力達(dá)到了上限，其對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響也達(dá)到了最大（圖1）。

2.2 碳酸酐酶胞外酶對(duì)微藻穩(wěn)定碳同位素組成的影響

從處理后的微藻穩(wěn)定碳同位素組成來(lái)看，微藻δ13C 值隨添加AZ 濃度的增加，呈不斷偏負(fù)的趨勢(shì)（表1），尤其是在添加高濃度AZ 條件下，對(duì)微藻藻體的δ13C 值影響最大。與未添加AZ 條件下的微藻δ13C 相比，添加高濃度AZ，微藻δ13C 偏負(fù)約5‰。結(jié)合相關(guān)研究，添加高濃度AZ 處理下，純培養(yǎng)的萊茵衣藻和蛋白核小球藻的穩(wěn)定碳同位素分餾-9‰左右[17]。相同的是：添加AZ，對(duì)微藻δ13C 都是產(chǎn)生偏負(fù)的影響；不同的是：AZ 對(duì)微藻δ13C 產(chǎn)生的影響程度跟微藻本身固有的碳酸酐酶活性有關(guān)，微藻碳酸酐酶活性越強(qiáng)，AZ 對(duì)其產(chǎn)生的影響越大。巖溶湖泊微藻屬于多種微藻的混合物，既有以綠藻為代表的碳酸酐酶胞外酶活性強(qiáng)的微藻，也有以硅藻為代表的碳酸酐酶胞外酶活性微弱的微藻，甚至還存在以銅綠微囊藻等為代表的沒(méi)有碳酸酐酶的微藻[21]?？傊?，巖溶湖泊微藻的碳酸酐酶胞外酶活性遠(yuǎn)低于室內(nèi)純培養(yǎng)的萊茵衣藻的碳酸酐酶胞外酶活性。

2.3 微藻碳酸酐酶胞外酶對(duì)不同碳源利用及碳匯能力估算

隨著添加AZ 濃度的增加，微藻利用培養(yǎng)液中添加的無(wú)機(jī)碳的比例（fB）呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)(表2)，未添加AZ 條件下，微藻利用無(wú)機(jī)碳的比例是0.06；添加高濃度AZ 條件下，微藻利用無(wú)機(jī)碳的比例最高達(dá)到了0.14。但是，微藻對(duì)添加無(wú)機(jī)碳的利用比例普遍較低。由此可知，巖溶湖泊微藻所利用的碳源主要來(lái)自大氣CO2，它占到了微藻利用總無(wú)機(jī)碳份額的94%。碳酸酐酶對(duì)巖溶系統(tǒng)碳碳循環(huán)具有明顯的驅(qū)動(dòng)作用[22]，且碳酸酐酶胞外酶主要是促進(jìn)微藻利用大氣無(wú)機(jī)碳源，并快速增加微藻進(jìn)行光合作用的能力[4-5]?？傊⒃逄妓狒赴饷改軌虼龠M(jìn)微藻的光合碳匯能力（CSp）。[AZ]a-培養(yǎng)液中添加的AZ濃度； M-微藻生物量的增殖倍數(shù)； fB-微藻吸收利用培養(yǎng)液中添加的碳源的份額 ；CSk-巖溶碳匯能力； CSp-光合碳匯能力； P-相比于未添加AZ的湖泊自然狀態(tài)下的微藻碳匯能力的比例。

表2 AZ 濃度梯度處理下的微藻對(duì)不同碳源的利用及碳匯估算Table 2 Utilization of different carbon source and estimation of carbon sinks by microalgae under different concentrations of AZ

基于以上結(jié)果，獲得了微藻對(duì)添加無(wú)機(jī)碳的利用比例，結(jié)合處理期間，以微藻蛋白質(zhì)為代表的生物量?jī)粼黾訑?shù)據(jù)，我們估算出了不同碳酸酐酶胞外酶活力條件下的微藻碳匯能力。在巖溶湖泊的自然水體中，碳酸酐酶胞外酶活性強(qiáng)的微藻碳匯能力是缺乏碳酸酐酶胞外酶的微藻碳匯能力的5 倍。碳酸酐酶胞外酶對(duì)微藻碳匯能力的影響顯著。蔣忠誠(chéng)等對(duì)水生植物體光合固碳效應(yīng)的研究也獲得了生物過(guò)程的參與，加快了巖溶區(qū)碳匯的貢獻(xiàn)[23]。

3 結(jié) 論

本研究基于雙同位素示蹤技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建計(jì)算模型，量化出了微藻對(duì)添加無(wú)機(jī)碳的利用比例，并獲得了微藻對(duì)大氣碳源的吸收利用比例。通過(guò)添加不同濃度的碳酸酐酶胞外酶特異性抑制劑AZ，模擬了碳酸酐酶胞外酶活性差異的各類(lèi)微藻，并獲得了不同微藻對(duì)大氣碳源的利用能力差異懸殊。

巖溶湖泊水體中，雖然固有的重碳酸鹽含量很高，但是，微藻利用的無(wú)機(jī)碳依然是主要來(lái)自于大氣二氧化碳（光合碳匯），而只是少量利用水體中固有的重碳酸鹽（巖溶碳匯）。碳酸酐酶胞外酶的主要貢獻(xiàn)是加快微藻對(duì)大氣二氧化碳的吸收利用及轉(zhuǎn)化效率，最終達(dá)到了促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，固碳增匯。這對(duì)人類(lèi)科學(xué)選擇利用碳酸酐酶胞外酶活性強(qiáng)的微藻來(lái)增加碳匯，服務(wù)于“碳中和”國(guó)家戰(zhàn)略，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。