桂琳，李靜，陳寶安，高峰，王筠，蔡曉輝

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蚌埠第三人民醫(yī)院血液科，安徽蚌埠 233000;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院血液科，江蘇南京 210009)

白血病的多藥耐藥是導(dǎo)致臨床上白血病化療失敗的主要原因之一，已經(jīng)證實(shí)人P-糖蛋白(P-gp)的過表達(dá)與腫瘤的多藥耐藥的發(fā)生密切相關(guān)。最近已有報(bào)道顯示，環(huán)氧合酶-2(COX-2)和腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥基因(multidrug resistance associated protein，MRP)1表達(dá)可增加MDR1基因產(chǎn)物P-gp的表達(dá)［1］。COX-2是前列腺素合成過程中的一個(gè)主要限速酶，在多種上皮來源的腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織中幾乎不表達(dá)。有研究表明，COX-2過表達(dá)與實(shí)體瘤多藥耐藥密切相關(guān)，是實(shí)體瘤多藥耐藥重要的促進(jìn)因素，但其確切的機(jī)制尚不清楚［2-3］。本研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和Western blotting方法檢測COX-2抑制劑塞來昔布、苦參堿單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞凋亡，MDR1、P-gp等表達(dá)變化的影響，探索COX-2與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，青霉素和鏈霉素均為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，塞來昔布為南京德寶生化器材有限公司提供，苦參堿注射液由遼寧玉皇藥業(yè)有限公司提供，阿霉素(ADM)為浙江海正藥業(yè)產(chǎn)品，MTT由美國Sigma公司提供，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是進(jìn)口分裝產(chǎn)品(原晶美產(chǎn)品)，RT-PCR試劑盒是Fermentas公司產(chǎn)品，COX-2單抗和P-gp單抗均為Abcam產(chǎn)品，COX-2基因、MDR1和GAPDH等引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(序列查自PubMed)。COX-2上游為TCTGAAACCCACTCCAAACAC，下游為 GCCCTCGCTTATGATCTGTC。MDR1上游為TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG，下游為 AGATCAG CAGGAAAGCAGCACCTA。GAPDH(614 bp)上游為GCCACATCGCTCAGACAC，下游為CATCACGCCACAG TTTCC。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞敏感株K562由本實(shí)驗(yàn)室長期保存，耐藥細(xì)胞株K562/AO2細(xì)胞是經(jīng)ADM逐步誘導(dǎo)、具有多藥耐藥MDR表型的穩(wěn)定細(xì)胞系，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供。K562/AO2細(xì)胞維持增殖的ADM終濃度為1.0 mg·L-1。將細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前無藥培養(yǎng)3 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)在98%以上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組:(1)K562陰性對照組(未加藥);(2)K562/AO2陽性對照組(未加藥);(3)ADM干預(yù)的K562/AO2組;(4)苦參堿干預(yù)的K562/AO2組;(5)塞來昔布干預(yù)的K562/AO2組;(6)苦參堿聯(lián)合塞來昔布干預(yù)的K562/AO2組;(7)苦參堿聯(lián)合ADM干預(yù)的K562/AO2組;(8)塞來昔布聯(lián)合ADM干預(yù)的 K562/AO2組;(9)苦參堿、塞來昔布聯(lián)合ADM干預(yù)的K562/AO2組。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞毒性作用

取對數(shù)生長期人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞敏感株K562及其耐藥細(xì)胞株K562/AO2分別調(diào)整細(xì)胞濃度至約2×105ml-1，以每孔200μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度、37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。2～4 h后加入不同濃度藥物，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24或48 h后加入20μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，充分溶解結(jié)晶物，平板振蕩儀振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長492 nm時(shí)的OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，求出半數(shù)抑制劑量(IC50)。藥物對細(xì)胞生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度A/對照組吸光度A)×100%;耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50;增敏倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/加逆轉(zhuǎn)劑后IC50。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞懸液密度調(diào)成8×104ml-1，分別加入ADM、苦參堿、塞來昔布以及苦參堿聯(lián)合塞來昔布、ADM。另設(shè)對照組(未加藥)，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后1 ml冷PBS離心洗滌2 次(1 500 r·min-1，5 min)，倒掉上清液，加入 500 μl結(jié)合緩沖液和5μl Annexin V-FITC重懸后室溫下避光放置20 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)。

1.6 RT-PCR方法檢測MDR1、COX-2 mRNA

分別收集經(jīng)ADM、苦參堿、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用后48 h的K562/AO2的各組細(xì)胞及對照組細(xì)胞。用Trizol法提取各組總RNA，然后利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，并取一定量cDNA加入目的基因引物片段進(jìn)行PCR反應(yīng)生成目的DNA基因復(fù)制產(chǎn)物，從而半定量測定目的基因mRNA的表達(dá)，未反應(yīng)cDNA保存于-20℃。本實(shí)驗(yàn)PCR體系總體積為25μl，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，退火30 s(內(nèi)參GAPDH退火溫度為53℃，MDR1和COX-2基因退火溫度為55℃)，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。以MDR1/GAPDH DNA和COX-2/GAPDH DNA光密度比值作為各組實(shí)驗(yàn)資料;每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 Western blotting法檢測細(xì)胞P-gp和COX-2蛋白的表達(dá)

分別收集經(jīng)ADM、苦參堿、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用后48 h的K562/AO2的各組細(xì)胞及對照組細(xì)胞后提取蛋白質(zhì)，BCA法(BCA試劑盒購自碧云天公司)測定蛋白質(zhì)含量。等量蛋白質(zhì)采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下?lián)u動封閉4 h后加入鼠抗人COX-2和P-gp抗體，在4℃過夜，室溫下洗膜后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育1 h;洗去未結(jié)合的二抗，加新鮮配置的顯色液，避光顯色20 min后終止反應(yīng)。P-gp和COX-2蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值除以β-actin內(nèi)參校正;每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用±s表示，兩樣本均數(shù)比較用方差檢驗(yàn)，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 逆轉(zhuǎn)劑及逆轉(zhuǎn)劑處理前后對K562細(xì)胞和K562/AO2細(xì)胞的毒性作用

ADM對K562/AO2細(xì)胞和K562細(xì)胞的IC50分別為 (33.31 ±2.51)、(0.40 ±0.03)μg·ml-1，耐藥倍數(shù)為83.69倍?？鄥A對 K562的IC50為(1 290.33±53.45)μg·ml-1，對 K562/AO2 的 IC50為(1 342.33 ±33.50)μg·ml-1，塞來昔布對K562的IC50為 (45.97±1.05)μg·ml-1，對 K562/AO2 的 IC50為(45.68 ±0.15)μg·ml-1，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？鄥A在≤225 μg·ml-1，塞來昔布在≤11.5 μg·ml-1時(shí)對細(xì)胞無明顯毒性作用(對細(xì)胞的生長抑制率＜10%)。我們選用苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5μg·ml-1為單獨(dú)及聯(lián)合用藥時(shí)的逆轉(zhuǎn)濃度，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用時(shí)毒性并沒有增加。苦參堿(200μg·ml-1)及塞來昔布(7.5μg·ml-1)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用于K562/AO2細(xì)胞時(shí)，ADM 對 K562/AO2細(xì)胞的 IC50分別為 9.44、12.84、2.71 μg·ml-1，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為 3.53、2.60、12.29倍。而對K562細(xì)胞IC50值并無明顯影響(圖1)。

圖1 各組藥物干預(yù)48 h后對K562/AO2細(xì)胞的抑制率

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

225μg·ml-1苦參堿及11.5 μg·ml-1塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用，對于K562/AO2細(xì)胞均沒有明顯的毒副作用。我們選定苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5 μg·ml-1、ADM 2 μg·ml-1為作用濃度，對于K562/AO2細(xì)胞其陽性對照組凋亡率為(3.25±0.53)%，單用ADM組凋亡率為(4.81±1.25)%，苦參堿聯(lián)合ADM組其凋亡率為(15.31±1.07)%，塞來昔布聯(lián)合ADM組其凋亡率為(12.72±0.98)%，而苦參堿、塞來昔布與ADM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡率為(29.82±0.23)%，可見應(yīng)用逆轉(zhuǎn)劑組凋亡率顯著增高，且兩逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡率最高。見圖2。

圖2 各組藥物干預(yù)K562/AO2細(xì)胞48 h后對凋亡率的影響

2.3 RT-PCR方法檢測MDR1、COX-2基因

對照組K562細(xì)胞和K562/AO2細(xì)胞的MDR1 DNA條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值分別為(3.72±1.62)%和(127.90±1.78)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對照組K562細(xì)胞和K562/AO2細(xì)胞的COX-2基因條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值分別為(1.47±0.86)%和(50.84±2.80)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？鄥A、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后，MDR1與GAPDH的比值分別為(70.76±9.65)%、(78.44±2.36)%和(30.57±5.99)%;苦參堿、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后，COX-2基因與GAPDH的比值分別為(26.42±3.29)%、(24.56±1.13)%和(8.36±2.83)%。加用逆轉(zhuǎn)劑后與對照組相比有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以兩個(gè)逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用時(shí)最明顯。見圖3～5。

圖3 各組藥物干預(yù)K562/AO2細(xì)胞48 h后COX-2mRNA內(nèi)參表達(dá)的變化

圖4 各組藥物干預(yù)K562/AO2細(xì)胞48 h后COX-2mRNA表達(dá)的變化

2.4 Western blotting法檢測細(xì)胞P-gp和COX-2蛋白的表達(dá)

對照組K562細(xì)胞和K562/AO2細(xì)胞的P-gp條帶與內(nèi)參條帶灰度比值分別為(2.02±0.47)%和(83.72±6.97)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對照組K562細(xì)胞和K562/AO2細(xì)胞的COX-2蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度比值分別為(1.33±0.48)%和(83.18±5.49)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？鄥A、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后P-gp與內(nèi)參的比值分別為(51.90±2.57)%、(40.62±4.51)%和(13.30±1.37)%;苦參堿、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后COX-2蛋白與內(nèi)參的比值為(50.82±6.30)%、(41.19±10.42)%和(13.75±6.12)%。加用逆轉(zhuǎn)劑后與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以兩個(gè)逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用時(shí)最明顯。見圖6。

3 討 論

化學(xué)治療是目前治療惡性腫瘤，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要手段之一?；熯^程中由于多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有遺傳不穩(wěn)定性，易于突變而產(chǎn)生的MDR是造成化療中斷、導(dǎo)致治療失敗的主要因素之一，也是腫瘤細(xì)胞對化療藥物毒性損傷最重要的自我保護(hù)防御機(jī)制之一。

腫瘤細(xì)胞的MDR產(chǎn)生的機(jī)制是復(fù)雜多樣的，可能的機(jī)制主要有:(1)藥物外排;(2)抗細(xì)胞凋亡;(3)其他，包括藥物代謝酶活性的變化(如GST、TopoⅡ、PKC)、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、微環(huán)境耐藥、激素受體量和親和力改變等機(jī)制。目前較多的研究表明，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR的主要原因是MDR1/P-gp的高表達(dá)。因而干預(yù)和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR，提高化療敏感性對惡性血液病的治療有積極意義［4-5］?？朔嗨幠退幍姆椒ㄖ皇鞘褂媚孓D(zhuǎn)劑，逆轉(zhuǎn)MDR能夠使化療失敗的幾率下降具有很高的臨床價(jià)值，MDR逆轉(zhuǎn)已成為目前國內(nèi)外化療藥物研究的重要方向之一。

圖5 各組藥物干預(yù)K562/AO2細(xì)胞48 h對MDR1mRNA表達(dá)的影響

圖6 各組藥物干預(yù)K562/AO2細(xì)胞48 h蛋白表達(dá)情況

近年來的研究發(fā)現(xiàn)許多癌前病變和惡性腫瘤有COX-2的過度表達(dá)，COX-2同時(shí)具有環(huán)氧化物酶和過氧化物酶兩種酶的活性，在腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)程中對細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤血管形成以及腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等均存在一定的關(guān)聯(lián)性［6-7］。COX-2促進(jìn)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制主要有:(1)促進(jìn)腫瘤新生血管的生成;(2)刺激腫瘤細(xì)胞的增殖;(3)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡;(4)促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移;(5)抑制機(jī)體的免疫反應(yīng);(6)參與前致物的活化。目前，COX-2及其抑制劑已成為抗腫瘤研究的又一熱點(diǎn)，有研究報(bào)道COX-2抑制劑對細(xì)胞增殖的影響作用途徑之一可能是通過調(diào)節(jié)P-gp的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)［8］。COX-2抑制劑用于實(shí)體瘤的多藥耐藥研究已有報(bào)道，用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的多藥耐藥的研究報(bào)道不多。本研究將基于近年來應(yīng)用單藥苦參堿或COX-2抑制劑塞來昔布逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的基礎(chǔ)上采用兩藥聯(lián)合應(yīng)用的方法，進(jìn)一步觀察兩藥聯(lián)合用于血液腫瘤時(shí)對多藥耐藥的影響。因中藥本身具有抗癌作用或者可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等協(xié)同化療藥物殺死腫瘤細(xì)胞，且中藥又具有來源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用小等特點(diǎn)，我們選用中西藥聯(lián)合作為逆轉(zhuǎn)劑，通過兩種藥物的協(xié)同作用可以使單藥的劑量減小，在獲得更好的治療效果的同時(shí)減少了毒副反應(yīng)。

本研究中MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:苦參堿≤225μg·ml-1、塞來昔布≤11.5μg·ml-1對K562細(xì)胞系和K562/AO2細(xì)胞系均無直接細(xì)胞毒性。苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5μg·ml-1能明顯增強(qiáng) ADM對 K562/AO2細(xì)胞系的殺傷作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苦參堿≤225μg·ml-1、塞來昔布≤11.5μg·ml-1能顯著增加ADM(2μg·ml-1)對K562/AO2細(xì)胞的凋亡率，單獨(dú)應(yīng)用 ADM時(shí)其凋亡率為(4.81±1.25)%，苦參堿聯(lián)合 ADM時(shí)凋亡率為(15.31±1.07)%，塞來昔布聯(lián)合ADM時(shí)凋亡率為(12.72±0.98)%，苦參堿和塞來昔布聯(lián)合ADM時(shí)凋亡率為(29.82±0.23)%。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K562/AO2細(xì)胞系的MDR1和COX-2mRNA高表達(dá)?？鄥A、塞來昔布單獨(dú)加用ADM作用時(shí)均可不同程度地使MDR1和COX-2mRNA表達(dá)下調(diào)，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)下調(diào)明顯，且MDR1和COX-2mRNA的表達(dá)具有明顯的一致性。在Western blotting法檢測細(xì)胞P-gp和COX-2蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中顯示了和RT-PCR實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。本研究顯示的化療藥物可通過誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)以及COX-2的表達(dá)與P-gp表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果，為MDR產(chǎn)生機(jī)制的研究提供新的方向，且對MDR的逆轉(zhuǎn)開辟了新的思路，COX-2選擇性抑制劑的使用可能成為臨床上逆轉(zhuǎn)MDR的選擇之一，有望提高抗腫瘤藥物療效。

［1］STEINBACH G，LYNCH PM，PNILLIPSRK，et al.The effect of celecoxib，a cyclooxygenase-2 inhibitor，in familial adenomatous poiyposis［J］.N Engl JMed，2000，342(26):1946-1952.

［2］MENTER D G，SEHILSKY R L，DUBOIS R N.Cyclooxygenase-2 and cancer treatment:understanding the risk should be，worththereward［J］.Clin Cancer Res，2010，16(5):1384-1390.

［3］張夢曦，顧康生.化療藥物與腫瘤細(xì)胞環(huán)氧化酶-2表達(dá)及多藥耐藥之間相互關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2009，14(4):377-380.

［4］壽倍明，陳寶安，周冬蕊，等.p16基因在K562/AO2細(xì)胞株表達(dá)情況的研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，27(3):151-153.

［5］楊曉華，沙慧芳，馮久賢，等.人肺腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的建立及其特性研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2009，37(1):34-37.

［6］YU L，WU W K K，LI Z J，et al.Enhancement of doxorubicin cytotoxicity on human esophageal squamous cell carcinoma cells by indomethacinand4-［5-(4-Chlorophenyl)-1H-Pyrazol-1-yl］benzenesul-fonamide(SC236)via inhibiting P-glycoprotein activity［J］.Mol Pharmacol，2009，75:1364-1373.

［7］WANG CH，ZHENGW B，QIANG O，et al.Effects of non-cytotoxic drugs on the growth ofmultidrug-resistance human gastric carcinoma cell line［J］.Journal of Digestive Diseases，2009，10:91-98.

［8］FANTAPPIè O，SOLAZZO M，LASAGNA N，et al.Multiple drug-resistant cell lines，P-glycoprotein mediates celecoxib-Induced apoptosis［J］.Cancer Res，2007，67:4915-4923.