戴建國(guó)，王中立，陳琳，趙玉男，詹，黃玉芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)科，江蘇南京 210046)

助陽(yáng)寧神方基于中醫(yī)臨床“助陽(yáng)入腦，降火寧神”抑郁癥治療思想，由南京中醫(yī)藥大學(xué)王旭東教授提出，該方由制附子、淫羊藿、酸棗仁和知母4味中藥組成，前兩者用于“助陽(yáng)”，后兩者用于“寧神”，分別作用于陰陽(yáng)兩端，調(diào)節(jié)抑郁癥患者陰陽(yáng)平衡紊亂。該方經(jīng)國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用，療效顯著。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):該方在強(qiáng)迫游泳和強(qiáng)迫懸尾實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯抗抑郁作用，但該方作用機(jī)制尚未明了，為此，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)其可能機(jī)制展開(kāi)初步研究。采用5-羥色氨酸(5-HTP)誘導(dǎo)的甩頭模型、育亨賓毒性模型檢測(cè)行為學(xué)改變，皮質(zhì)酮皮下注射制備應(yīng)激抑郁動(dòng)物模型，免疫組化及Western blot檢測(cè)給藥前和給藥4周后小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)改變，期望初步明確其治療機(jī)制，并能為該方的臨床應(yīng)用提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 成年健康雄性C57BL/6N小鼠，體重18～22 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào) SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫恒濕動(dòng)物房，明暗交替時(shí)間為12 h，動(dòng)物可以自由飲食進(jìn)水。

1.1.2 藥物、試劑 皮質(zhì)酮購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)079K1594;氟西汀由蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)8146B。5-HTP、帕吉林和育亨賓均購(gòu)自Sigma公司。其他試劑均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 皮質(zhì)酮皮下反復(fù)注射復(fù)制抑郁小鼠模型參考Zhao等［1］的研究。首先將皮質(zhì)酮溶于二甲基亞砜(DMSO)中作為儲(chǔ)液，根據(jù)所用藥水煎劑灌胃給予動(dòng)物，給藥劑量由人臨床常規(guī)用量換算成小鼠用量，設(shè)置助陽(yáng)寧神方高(7.6 g·kg-1)、中(3.8 g·kg-1)、低劑量(1.9 g·kg-1)組。陽(yáng)性藥物氟西汀根據(jù)臨床使用劑量，換算成小鼠用量為3.6 mg·kg-1。注射用帕吉林液由滅菌去離子水配成10 mg·ml-1液體，現(xiàn)配現(xiàn)用。注射用5-HTP由生理鹽水配成濃度為1 mg·ml-1液體，置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 生藥水煎劑的制備及給藥劑量 生藥在砂鍋中浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮20～30 min，濾出藥汁，反復(fù)3次，混合藥汁，濃縮即得，生藥質(zhì)量濃度計(jì)為 g·ml-1。

1.2.3 分組 根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分為6組(每組8只)，即模型組，正常組，氟西汀組，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組。除正常組外其他各組均給予造模處理。給藥與造模同時(shí)進(jìn)行，正常組和模型組給予蒸餾水，其他各組給予相應(yīng)劑量助陽(yáng)寧神方。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4周，第4周后處死小鼠，行免疫組化及Western blot檢測(cè)。

1.2.4 免疫組化染色 實(shí)驗(yàn)完成后給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔，左心室插管，剪開(kāi)右心耳，用預(yù)溫的37℃生理鹽水約20 ml快速?zèng)_洗，再以預(yù)冷的10%多聚甲醛灌注固定30 min后斷頭取腦，放入盛有相同10%多聚甲醛的瓶中固定24 h，利用小鼠腦模具將各組小鼠腦組織切割成等大的包含海馬區(qū)域的腦片，浸泡于30%蔗糖水中，待腦片沉入液體底部，取出應(yīng)用冰凍切片包埋劑包埋，冰凍切片。漂染法進(jìn)行兩步法免疫組織化學(xué)染色，具體操作流程如下:(1)滴加正常羊血清封閉，室溫30 min。(2)3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫15 min。(3)兔抗GFAP(1∶1 000)，4℃過(guò)夜。(4)聚合物羊抗兔IgG，37℃1 h。(5)使用DAB顯色試劑盒顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。在步驟(3)、(4)、(5)后均用0.01 mol·L-1PBS 漂洗3次，每次5 min。陰性對(duì)照試驗(yàn):省去一抗，用正常羊血清代替一抗。每組選取5張切片，每張3個(gè)視野，使用圖像分析系統(tǒng)Imagepro-Plus統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞面積及總光密度值。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 雙側(cè)海馬組織用1 ml的RIPA 緩沖液［50 mmol·L-1Tris-HCl、0.1%SDS、1%NP-40、1 mmol·L-1EDTA、150 mmol· L-1NaCl、1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mg·L-1抑肽酶、1 mg·L-1亮抑肽酶，去離子水配置，pH 7.5］勻漿，12 000 r·min-1離心后取上清液。對(duì)所得上清液進(jìn)行蛋白定量以確定電泳時(shí)樣品的上樣量，然后按比例加入上樣緩沖液［1%SDS、1% 二硫蘇糖醇(DTT)、10 mmol· L-1Tris-HCl、10% 甘 油、1 mmol· L-1EDTA、0.2%溴酚藍(lán)，去離子水配置，pH 8.0］，混合后在95℃水浴中變性5 min。變性的樣品液經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，用PBST(含0.05% 吐溫-20的PBS液)稍加漂洗后放入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST液)中，37℃振蕩1 h。封閉結(jié)束后，一抗室溫輕搖孵育2 h或4℃靜置過(guò)夜。PBST漂洗3次(每次5 min)后，二抗室溫孵育1 h。PBST再次漂洗3次，采用化學(xué)發(fā)光法，暗室曝光顯影膠片。最后，將膠片上目的條帶掃描進(jìn)電腦，用Bandscan軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為模型 實(shí)驗(yàn)分為正常組，氟西汀組，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組(劑量同上)，共5組，每組10只ICR小鼠。按100 mg·kg-1的劑量皮下注射帕吉林液(10 ml·kg-1)，90 min后按10 mg·kg-1的劑量腹腔注射5-HTP，在連續(xù)給藥7 d后第15 min分別記錄各組小鼠甩頭行為次數(shù)。

1.2.7 育亨賓毒性模型 動(dòng)物分組、動(dòng)物數(shù)與給藥同“1.2.6”。按2.5 mg·kg-1的劑量腹腔注射育亨賓(10 ml·kg-1)，注射1 h后觀察各組死亡小鼠只數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用±s)表示，多組比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 海馬GFAP表達(dá)結(jié)果

2.1.1 Western blot檢測(cè)GFAP表達(dá)結(jié)果 與正常組相比，模型組小鼠海馬組織內(nèi)GFAP表達(dá)明顯下降(P＜0.01);與模型組比，氟西汀組和助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組均能上調(diào)GFAP表達(dá)(均P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 GFAP的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig 1 The results of GFAP by Western blot

2.1.2 GFAP免疫組化表達(dá)結(jié)果 在海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)，與正常組比，模型組GFAP陽(yáng)性區(qū)域總光密度值和面積均明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，與模型組比，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組均能顯著上調(diào)GFAP陽(yáng)性區(qū)域總光密度值(P＜0.05或P＜0.01);在CA3區(qū)助陽(yáng)寧神方高、中劑量組及在CA1區(qū)助陽(yáng)寧神方中劑量組GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域面積明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);在DG區(qū)，各組GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域面積均無(wú)明顯上調(diào)(P＞0.05)，但GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域總光密度值明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 海馬陽(yáng)性區(qū)域面積結(jié)果Fig 2 The positive results of hippocampus area

圖3 海馬陽(yáng)性區(qū)域總光密度值結(jié)果Fig 3 Hippocampal positive regional total optical density value result

2.2 5-HTP誘導(dǎo)的甩頭模型結(jié)果

鹽酸氟西汀可高選擇性抑制突觸前膜對(duì)5-羥色胺(5-HT)的再攝取，提高中樞濃度，能明顯增加5-HTP誘導(dǎo)的小鼠甩頭行為次數(shù)，因此，與正常組(67±18.92)比，氟西汀組小鼠甩頭行為次數(shù)顯著增加(416.5±125.96，P＜0.01);而助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組小鼠甩頭次數(shù)均未明顯增加(61.4±14.28，48.25±11.96，57.6±10.74，均P＞0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 給藥后不同組5-HTP誘導(dǎo)的甩頭次數(shù)(n=10)Fig 4 The results of head-twitching behavior in different groups after administration

2.3 育亨賓毒性模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

育亨賓毒性模型中，與正常組小鼠死亡1只相比，氟西汀組死亡5只，小鼠死亡率顯著增加(P＜0.05)，而助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組死亡小鼠數(shù)依次是2、1、1只，與正常組比，小鼠死亡率無(wú)顯著性增加(均P＞0.05)。

3 討 論

抑郁癥是一種以心境低落為主要特征的情感性精神障礙，其發(fā)病率逐年升高。據(jù)WHO報(bào)道，目前抑郁癥已成為世界第四大疾患，到2020年可能成為僅次于缺血性心臟病的第二大疾病，因此，其防治研究備受關(guān)注。臨床常用的抗抑郁藥多為基于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)，即通過(guò)調(diào)節(jié)突觸間隙單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)發(fā)揮療效。張杰等［2］研究了醫(yī)院銷(xiāo)售金額、用藥頻度等數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥中選擇性5-HT再攝取抑制劑應(yīng)用占主導(dǎo)地位。然而該類(lèi)藥物對(duì)部分患者療效欠佳，因此，探索新的有效治療藥物和方法逐漸成為研究熱點(diǎn)。如張曉斌等［3］就應(yīng)激以及氟西汀對(duì)抑郁模型大鼠海馬區(qū)GDNFmRNA表達(dá)影響進(jìn)行探討，期望通過(guò)對(duì)抑郁癥與星型膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系研究可進(jìn)一步理解抑郁癥的病理生理機(jī)制以及新型抗抑郁藥物的作用機(jī)理。

在5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為模型中發(fā)現(xiàn)，與正常組比，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組小鼠甩頭次數(shù)無(wú)明顯增多(P＞0.05)，而氟西汀組(5-HT再攝取抑制劑)卻可通過(guò)高選擇性抑制突觸前膜對(duì)5-HT的再攝取提高中樞濃度，能明顯上調(diào)5-HTP誘導(dǎo)小鼠的甩頭行為次數(shù);育亨賓毒性模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組小鼠死亡只數(shù)未見(jiàn)明顯增加(P＞0.05)，因此推測(cè)，該方抗抑郁作用可能不是通過(guò)影響單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)而產(chǎn)生，其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)抑郁動(dòng)物模型采用 Zhao等［1，4］的方法，該模型穩(wěn)定，方法簡(jiǎn)單，制備容易，重復(fù)性好，目前已被國(guó)內(nèi)外大量使用于抗抑郁藥物的篩選，為此，本實(shí)驗(yàn)采用該模型。陳紅霞等［5］認(rèn)為海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共同參與了抑郁癥發(fā)生，胍丁胺和氟西汀可逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，發(fā)揮抗抑郁作用。Banasr等［6］認(rèn)為僅星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失就足以引起抑郁癥產(chǎn)生。說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥產(chǎn)生中起重要作用。GFAP作為星形膠質(zhì)細(xì)胞特性骨架蛋白，為星形膠質(zhì)細(xì)胞獨(dú)有，其表達(dá)高低反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)酮應(yīng)激模型上，模型組GFAP表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞活性下降，而助陽(yáng)寧神方高、中、低劑量組均能上調(diào)GFAP表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，模型組GFAP陽(yáng)性表達(dá)總光密度值明顯下調(diào)，助陽(yáng)寧神方各組均能上調(diào)海馬CA1、CA3、DG區(qū)GFAP陽(yáng)性表達(dá)總光密度值;CA1、CA3區(qū)GFAP陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域面積也上調(diào)，說(shuō)明助陽(yáng)寧神方水煎劑能上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性。因此，助陽(yáng)寧神方可能通過(guò)上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性而發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，助陽(yáng)寧神方拮抗小鼠抑郁樣作用可能不是通過(guò)影響單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生，而是可能與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性有關(guān)，但其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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