陳猛，郝林，史振鐸，張輝，董洋，韓從輝

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州 221009)

基因治療膀胱癌是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)，腺病毒是常用的載體之一。而超抗原靶向抗腫瘤模式為腫瘤治療提供了一個(gè)新的方向，并顯示出良好的應(yīng)用前景。我們根據(jù)端粒酶高表達(dá)于人惡性腫瘤和缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)的特點(diǎn)構(gòu)建了攜帶超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxins A，SEA)基因的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/HIF雙調(diào)控溶瘤腺病毒PPE3-SEA。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPE3-SEA對(duì)人膀胱腫瘤EJ細(xì)胞具有殺傷作用［1］。然而免疫治療使得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)無(wú)法使用裸鼠模型，因此hTERT啟動(dòng)子和HIF啟動(dòng)子能否在鼠腫瘤細(xì)胞中與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使SEA表達(dá)成為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。Shieh等［2］實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠膀胱癌MBT-2中hTERT啟動(dòng)子具有明顯活性并能使其下游的胞嘧啶脫氨酶基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察PPE3-SEA能否感染小鼠膀胱癌MB49并表達(dá)SEA基因。

1 材料和方法

1.1 材料

腺病毒PPE3-SEA由實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建并保存，小鼠膀胱癌細(xì)胞MB49由天津泌尿外科研究所提供，RT-PCR試劑盒購(gòu)自南京凱基公司，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)引物合成于南京金斯瑞公司，SEA單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 生物倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞感染腺病毒后形態(tài)學(xué)變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MB49細(xì)胞胰酶消化、離心，分別計(jì)數(shù)5×103接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后分別加入0、5、10、40 MOI腺病毒感染細(xì)胞，每組8個(gè)復(fù)孔。分別于12、24、48 h在OLYMPUS生物倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。

1.3 RT-PCR檢測(cè)PPE3-SEA在MB49細(xì)胞內(nèi)SEA的mRNA表達(dá)

根據(jù)GenBank已知的SEA基因序列用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物:5'-TAGCGAGAAAAGCGAA-3'，下游引物:5'-ATCCAACTCCTGAACAG-3'。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MB49細(xì)胞胰酶消化、離心，計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞加入10個(gè)培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后分別加入0、5、10、40 MOI腺病毒感染細(xì)胞，分別于 12、24、48 h 提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后按試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性40 s，52℃退火30 s，72℃延伸35 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)液5μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

1.4 Western blot檢測(cè)SEA蛋白表達(dá)

取各組細(xì)胞于冷PBS洗滌后加入400μl冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30 min，每隔5 min渦旋振蕩10 s，充分裂解后離心取上清分裝。Bradford法蛋白定量后用裂解緩沖液稀釋相同濃度，煮沸5 min后加樣電泳，濕電轉(zhuǎn)移，封閉;一抗1∶200稀釋，搖床搖蕩孵育;二抗1∶5 000稀釋，室溫下?lián)u蕩孵育2 h;加顯影液后曝光，顯影，洗像。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

未加腺病毒的細(xì)胞呈梭形;感染腺病毒的細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，呈葡萄狀排列。病變細(xì)胞隨濃度的增加而增多，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞折光性進(jìn)一步增強(qiáng)，最終裂解(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

用SEA引物分別對(duì)陰性對(duì)照組48 h及實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示SEA在實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段細(xì)胞中RNA水平成功表達(dá)，而陰性對(duì)照組未表達(dá)(圖2)。

2.3 Western blot檢測(cè)SEA蛋白表達(dá)

取陰性對(duì)照組48 h和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組未檢測(cè)到SEA蛋白表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組均檢測(cè)到SEA蛋白(圖3)。

3 討 論

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其臨床分期、病理學(xué)分級(jí)與多種基因表達(dá)相關(guān)［3-5］。目前治療膀胱癌的主要方法是以手術(shù)為主，術(shù)后輔以膀胱內(nèi)灌注治療，但復(fù)發(fā)率高，治療效果遠(yuǎn)不能讓人滿意。陳波等［6］回顧性分析經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)加二次經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療膀胱腫瘤，術(shù)后膀胱灌注吡柔比星，膀胱癌總復(fù)發(fā)率仍為18.37%，而開(kāi)放行膀胱癌部分切除術(shù)組的總復(fù)發(fā)率高達(dá)33.5%。自Morales等［7］首先使用卡介苗(bacillus calmette-guerin，BCG)治療膀胱癌以來(lái)，膀胱癌的免疫治療得以迅速發(fā)展，但BCG膀胱灌注的并發(fā)癥(膀胱炎、血尿、發(fā)熱、肉芽腫、肺炎、膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、輸尿管梗阻和膀胱痙攣等)限制了其廣泛應(yīng)用。在免疫治療過(guò)程中也可能會(huì)出現(xiàn)與免疫相關(guān)的疾病，因此膀胱癌的靶向免疫治療成為新的研究方向和熱點(diǎn)。hTERT啟動(dòng)子被廣泛用于構(gòu)建溶瘤腺病毒攜帶目的基因靶向治療腫瘤。在hTERT和mTERT啟動(dòng)子的核心區(qū)有50%的相似性。Gu等［8］用 Ad/hTERT-LacZ感染小鼠纖維肉瘤細(xì)胞UV-2237m、Lewis肺癌細(xì)胞LLC、M109肺癌細(xì)胞、小鼠肺腺癌LM2細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3和正常鼠成纖維細(xì)胞NMFB檢測(cè)hTERT啟動(dòng)子的活性，結(jié)果表明hTERT啟動(dòng)子能有效地使用小鼠轉(zhuǎn)錄機(jī)，在小鼠腫瘤細(xì)胞中具有高活性而在正常細(xì)胞中相對(duì)靜止。我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PPE3-SEA腺病毒可以感染小鼠膀胱癌細(xì)胞MB49，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解并于感染腺病毒組均檢測(cè)到SEA的mRNA和蛋白的表達(dá)，再次證實(shí)hTERT啟動(dòng)子和HIF啟動(dòng)子能有效使用小鼠轉(zhuǎn)錄機(jī)。小鼠基因組測(cè)序計(jì)劃已完成，人類99%的基因存在于小鼠，基因組同源性高達(dá)78.5%，93%的區(qū)域基因排列順序與人類相同。龍躍生等［9］分析證明，人和小鼠SCN3A基因核心啟動(dòng)子的同源性高達(dá)96.0%。以上研究結(jié)果為以啟動(dòng)子作為靶向治療方法的實(shí)驗(yàn)提供了新的參考方向和理論依據(jù)。

圖1 顯微鏡下不同濃度腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后的各時(shí)段細(xì)胞形態(tài) ×200Fig 1 The cellular morphology of different time after infected by different concentration adenovirus under the microscope ×200

圖2 不同濃度腺病毒組各時(shí)段反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定Fig 2 The identification of reverse transcription's production

圖3 Western blot結(jié)果Fig 2 The results of Western blot

［1］胡建鵬，郝林，張培影，等.雙調(diào)控溶瘤腺病毒介導(dǎo)超抗原SEA基因靶向膀胱癌腫瘤表達(dá)［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27(8):1131-1133.

［2］SHIEH G S，SHIAU A L，YO Y T，et al.Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model［J］.Cancer Res，2006，66(20):9957-9966.

［3］楊立新，張海峰，白淑芬.P53、Ki-67基因表達(dá)與膀胱癌相關(guān)性的回顧性研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38(1):32-35.

［4］應(yīng)文群，李巧星.hTERT和survivin在膀胱癌移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2006，19(1):19-20.

［5］何汀，陳明，章宜芬，等.Mel-18在人膀胱尿路上皮腫瘤組織中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2010，38(3):212-216.

［6］陳波，賀厚光，韓從輝，等.二次經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切治療非浸潤(rùn)性膀胱腫瘤［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，29(6):665-667.

［7］MORALESA，EIDENGER D，WARD A W.Intracavity Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumours［J］.JUrol，1976，116(2):180-183.

［8］GU J，ANDREEFF M，ROTH J A，et al.hTERT promoter induces tumor-specific Bax gene expression and cell killing in syngenic mouse tumor model and prevents systemic toxicity［J］.Gene Ther，2002，9(1):30-37.

［9］龍躍生，趙綺華，曾濤，等.人及小鼠鈉通道SCN3A基因的啟動(dòng)子及其上游調(diào)控區(qū)的分析［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36(3):339-345.