張偉偉， 邵淑麗， 張珍珠， 付 博

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

三尖杉酯堿(harringtonine，HT)是從海南粗榧屬植物中提取的抗腫瘤藥物，具有細胞毒、DNA 合成抑制及染色體損傷等作用［1－2］，能誘導白血病細胞HL60 凋亡［3－7］。但在治療中，白血病和腫瘤細胞的藥物不敏感性或耐藥性的產生，往往導致治療的失敗。腫瘤多藥耐藥產生的機制較為復雜，包括ATP結合轉運蛋白家族成員的過表達［8］、拓撲異構酶II活性的改變、谷胱甘肽－S－轉移酶的修飾［9］、細胞凋亡抑制基因bcl－2［10］的過表達及p53 基因的突變等。其中，ATP 結合轉運蛋白家族成員多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因的過表達成為經典的多藥耐藥表型［11］，在近50%的人類癌癥中存在高表達。P－糖蛋白(P－glycoprotein)又稱多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)可以利用ATP 水解釋放的能量將化療藥物泵出細胞外，使細胞內藥物濃度始終維持在低水平，減弱藥物的細胞毒作用，從而導致細胞對結構和作用機制不同的多種藥物產生耐藥性。本實驗利用RNA 干擾的方法，設計1 條靶向MDR1 的shRNA，穩(wěn)定轉染HT9 細胞后，檢測HT9 細胞對三尖杉酯堿的敏感性，探討靶向MDR1 基因的shRNA 對三尖杉酯堿誘導的HT9細胞凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

質粒pSilencer 3.1－H1 neo 購自北京鼎國生物公司，敏感的和耐三尖杉酯堿的人白血病細胞株HL60 和HT9 來源于北京師范大學生命科學學院，RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清(上海生工);C219 抗體(Signet)，β－actin 抗體(Signet)，IgG (Jakson ImmunoResearch Lab)，ECM830 型電穿孔儀(BTX);熒光定量PCR 儀(ABI PRISM 7700);流式細胞儀FC500(貝克曼)，激光共聚焦顯微鏡 (Olympus FV500)。

2 方法

2.1 MDR1 shRNA 表達載體的構建 根據GenBank MDR1 mRNA 的已知序列(NM_000927)，選擇shRNA 特異性靶位點序列。設計合成MDR1 shRNA 的DNA 模板，將其定向克隆到pSilencer 3.1－H1 neo 載體上，shRNA 表達質粒命名為pSilencer 3. 1－MDR1。連接產物轉化，提取質粒，測序鑒定。以含隨機序列的pSilencer 3.1－H1 neo 質粒為陰性對照。

2.2 細胞的培養(yǎng)及轉染 細胞均用含10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HT9 細胞，通過pEGFP－N1質粒優(yōu)化電轉染條件，線性化的重組質粒于最佳電轉染條件下電轉染HT9 細胞，用600 mg/L G418 篩選建立穩(wěn)定表達siRNA 的HT9 細胞克隆。有限稀釋法挑取單克隆轉染細胞分別得到HT9/sh－3. 1(轉染pSilencer 3.1－H1 neo)和HT9/sh－3. 1－1(轉染pSilencer 3.1－MDR1)。

2.3 實時熒光定量PCR 檢測MDR1 mRNA 采用UNIQ－10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒(Sangon)提取細胞總RNA。MDR1 正義鏈ATATCAGCAGCCCACATCAT，反義鏈GAAGCACTGGGATGTCCGGT，擴增產物為154 bp。以β－actin 為內參照，β－actin正義鏈 ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，反義鏈CATCTCTTGCTCGAAGTCCA，擴增產物為318 bp。實時熒光定量PCR 擴增條件:94 ℃3 min，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃1 min，循環(huán)35 次，72 ℃檢測信號，循環(huán)結束后進行熔解曲線檢測。實驗重復3次，數(shù)據以2－ΔΔCt)進行計算。

2.4 Western blotting 檢測MDR1 蛋白的表達 收集未轉染和穩(wěn)定轉染重組質粒的HT9 細胞，提取總蛋白，樣品進行SDS－PAGE 凝膠電泳，用Bio－Rad 電轉儀將蛋白轉移到PVDF 膜上，轉膜條件為150 V 恒壓3 h，5%脫脂奶粉封閉1h，加C219 Ⅰ抗(1∶100)，內參照β－actinⅠ抗4 ℃孵育過夜，PBS 洗膜，加Ⅱ抗IgG(1∶10 000)，室溫孵育2 h，ECL 發(fā)光液發(fā)光成像，用凝膠圖像分析軟件分析灰度值。

2.5 MTT 法檢測耐藥逆轉效果 細胞中分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L 三尖杉酯堿，常規(guī)MTT 法檢測，測得實驗組細胞和耐藥細胞的存活率，570 nm 下測吸光度(A)。細胞存活率(%)=A(實驗組)/A(對照組)×100%，以藥物濃度為橫軸，細胞存活率為縱軸繪制濃度效應曲線，求出回歸方程，確定半數(shù)抑制濃度(IC50)并計算相對逆轉率，實驗重復3 次。

2.6 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡 細胞中加入1.0 mg/L 三尖杉酯堿作用24 h 后，按照凋亡細胞DNA 提取試劑盒(上海生工)說明書提取各組細胞DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 片段化。

2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內染色體形態(tài)結構

細胞中分別加入1.0 mg/L 三尖杉酯堿作用24 h后，800 r/min 離心10 min 收集細胞，預冷的PBS 洗3次，0.5 g/L 吖啶橙(acridine orange，AO)37 ℃孵育10 min。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內染色體形態(tài)。

2.8 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞中分別加入終濃度為1.0 mg/L 三尖杉酯堿作用24 h 后，800 r/min 離心10 min 收集細胞，加入1 mL－20 ℃預冷的70%乙醇，充分混勻，4 ℃保存，固定至少18 h，調整細胞濃度為1 ×109/L，取1 mL 細胞懸液，用PBS 洗3 次，細胞重懸于1 mL 含20 mg/L RNase A 和50 mg/L PI 的染液中，37 ℃孵育30 min，流式細胞儀檢測(汞激發(fā)波長為488 nm)。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據處理，進行單因素方差分析(One－way ANOVA)，組間比較用LSD 法檢測其差異性，數(shù)據以均數(shù)±標準差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MDR1 shRNA 表達載體的鑒定

經測序結果鑒定，重組質粒的堿基序列與預期結果一致，重組質粒構建成功，見圖1。

Figure 1. The analysis of target sequence in the recombinant plasmid.圖1 重組質粒pSilencer 3.1－MDR1 中shRNA 的序列分析

2 pEGFP－N1 質粒優(yōu)化電轉染條件

電轉染時間定為30 ms，分別調節(jié)電壓為240 V、250 V、260 V、270 V、280 V 和290 V 進行電轉染條件的摸索。結果顯示，電壓為280 V 時，細胞存活率在40% ～50%之間，有約70%的細胞發(fā)綠色熒光，見圖2，因此，確定脈沖時間30 ms、電壓280 V 為電轉染HT9 細胞的最佳條件。

Figure 2. The expression of green fluorescent protein in HT9 cells (× 200). A:under phase－contrast microscope;B:under fluorescence microscope.圖2 綠色熒光蛋白在HT9 細胞中表達

3 熒光定量PCR 檢測MDR－1 mRNA 的表達

應用定量PCR 儀自帶數(shù)據分析軟件獲得Ct 計算出各組細胞MDR－1 mRNA 表達值，計算各實驗組細胞MDR1/β－actin 的值。結果表明，重組質粒pSilencer 3.1－MDR1 可以顯著降低HT9 細胞MDR1 mRNA 的表達，單克隆細胞HT9/sh－3. 1－1 的MDR1/β－actin mRNA 比值明顯降低，與HT9 細胞相比單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 mRNA 的表達降低了75.4%(P ＜0.01)，見圖3。

4 Western blotting 檢測MDR1 蛋白的表達

重組質粒pSilencer 3.1－MDR1 可以顯著降低HT9 細胞DMR1 蛋白的表達，單克隆細胞HT9/sh－3. 1－1的MDR1/β－actin比值明顯降低，與HT9細胞相比單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 蛋白的表達降低了41.13%(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 3. The expression level of MDR1 mRNA in different cells.±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs HT9;△P ＜0.05 vs HT9/sh－3.1－1.圖3 各組細胞中MDR1 mRNA 的表達水平

5 多藥耐藥逆轉效果

MTT 檢測顯示，與HT9 細胞相比，穩(wěn)定表達陽性單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 抗腫瘤藥的IC50顯著降低(P ＜0.01)，見表1。

6 三尖杉酯堿作用后各組細胞的DNA 片段化

提取細胞基因組DNA，進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，凋亡細胞的DNA 顯示出180 ～200 bp 及其不同倍數(shù)的梯帶，這被視為最典型的凋亡指標。DNA凝膠電泳結果顯示，與HT9 細胞相比，穩(wěn)定表達陽性單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 的DNA ladder 更明顯，細胞染色質DNA 裂解成180 ～200 bp 大小不等的片段，而HT9/sh－3.1 細胞則沒有出現(xiàn)凋亡細胞特有的梯帶，見圖5。

7 三尖杉酯堿對各組細胞形態(tài)的影響

Figure 4. The expression level of MDR1 protein in different cells. ±s.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs HT9;△P ＜0.05 vs HT9/sh－3.1－1.圖4 各組細胞中MDR1 蛋白的表達水平

表1 三尖杉酯堿作用24 h 后各組細胞的IC50Table 1. The IC50 of harringtonine for different cells (±s.n=3)

表1 三尖杉酯堿作用24 h 后各組細胞的IC50Table 1. The IC50 of harringtonine for different cells (±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs HT9.

Group IC50(mg/L) Reversal fold Reversal rate(%)HT9 1.184±0. 130 104.78±6.57—HT9/sh－3.1 1.128±0. 160 99.78±7.41 4.817±1.390 HT9/sh－3.1－1 0.711±0.010＊＊ 62.91±2.96＊＊ 40.350±2.810 HL60 0.011±0.019＊＊—

Figure 5. Comparison of DNA ladder in different cells.M:DNA marker;1:HT9 cells;2:HT9/sh－3. 1 cells;3:HT9/sh－3.1－1 cells;4:HL60 cells.圖5 各組細胞DNA ladder 的比較

各組細胞經三尖杉酯堿處理，用吖啶橙染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，如圖6 所示，HL60 細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，染色質高度凝集和邊緣化，細胞質出泡，出現(xiàn)凋亡小體，見圖6A;穩(wěn)定轉染的HT9/sh－3.1－1 細胞胞核呈現(xiàn)大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀或梅花狀，為典型的細胞凋亡形態(tài)，見圖6D，HT9 細胞和HT9/sh－3.1 細胞未出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。

8 三尖杉酯堿對細胞周期的阻滯作用

HT9、HT9/sh－3.1、HT9/sh－3. 1－1 和HL60細胞經三尖杉酯堿誘導24 h 后收集，流式細胞儀檢測，結果表明，與HT9 細胞相比，HT9/sh－3.1 細胞的細胞周期未發(fā)現(xiàn)顯著變化，HT9/sh－3.1－1 細胞的S 期細胞增多，并出現(xiàn)明顯的凋亡亞峰，見圖7。

討 論

白血病是最常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前聯(lián)合化療仍然是白血病治療的重要措施，而白血病細胞多藥耐藥的產生則使部分白血病的化療最終歸于失敗。隨著耐藥機制研究的一步步深入，各種耐藥逆轉劑等也不斷涌現(xiàn)，主要包括基因治療［12］、免疫療法［13］和藥物治療。其中RNA 干擾是近年來發(fā)展起來的一項特異性抑制基因表達的基因治療方法。RNA 干擾最主要的功能是調節(jié)和關閉特定基因的表達進而調控細胞的各種高級生命活動。這一特異、有效的基因沉默技術現(xiàn)已被廣泛應用于白血病多藥耐藥等方面的研究。張敏等［14］研究了靶向mdr1 4個不同位點的siRNA 對耐藥細胞MDR 的逆轉效果，結果顯示4 條siRNA 轉染72 h 后K562/A02 細胞對ADR 的敏感性增強，相對逆轉率依次為90.61%、54.27%、96. 39% 和85. 32%。邵淑麗等［15］針 對MRP1 基因構建了2 個shRNA 表達載體轉染肺癌細胞株A549/DDP 后MRP1 mRNA 和MRP1 蛋白表達均顯著降低，細胞內Rho123 相對熒光強度明顯提高;轉染后細胞對DDP 的IC50和對5－FU 的IC50均顯著降低，有效逆轉了A549/DDP的多藥耐藥。本實驗成功構建了shRNA 表達載體pSilencer 3. 1－MDR1，穩(wěn)定轉染后，經熒光定量PCR 和Western blotting 檢測，與HT9 細胞相比單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 MDR1 mRNA 的表達降低了75.4%(P ＜0.01)，MDR1 蛋白的表達降低了41.13%(P ＜0.05)。夏忠勝等［16］在結腸癌細胞的研究中得到相似結果。眾所周知，MDR1 能將化療藥物泵出細胞外，使細胞內藥物濃度始終維持在低水平，減弱藥物的細胞毒作 用。經 載 體p Silencer3. 1－H1 neo－MDR1 轉 染后，單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 中MDR1 的表達顯著降低，三尖杉酯堿的IC50亦顯著降低，相對逆轉率為40.35%。這為后續(xù)細胞凋亡研究打下基礎。

Figure 6. Morphology of the chromatin in the cells treated with harringtonine under laser confocal microscope(acridine orange staining，×400).A:HL60 cells;B:HT9 cells;C:HT9/sh－3.1 cells;D:HT9/sh－3.1－1 cells.圖6 激光共聚焦下各組細胞染色質的形態(tài)

Figure 7. Apoptosis of the cells treated with harringtonine detected by flow cytometry. A:HL60 cells;B:HT9 cells;C:HT9/sh－3.1－1 cells;D:HT9/sh－3.1 cells.圖7 流式細胞術檢測各組細胞凋亡

在獲得穩(wěn)定轉染pSilencer 3.1－MDR1 重組質粒的陽性單克隆細胞后，我們檢測了HT9 細胞和單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 對三尖杉酯堿的敏感性。結果表明，與HT9 細胞相比，穩(wěn)定表達陽性單克隆細胞HT9/sh－3.1－1 的DNA ladder 更明顯，細胞染色質DNA 裂解成180 ～200 bp 大小不等的片段;在激光共聚焦顯微鏡下，經三尖杉酯堿處理的HT9 細胞和HT9/sh－3.1 細胞染色質分布均勻，而HT9/sh－3.1－1 細胞染色質濃縮，出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的碎片狀或梅花狀等典型的細胞凋亡形態(tài);另外，利用流式細胞術研究三尖杉酯堿對細胞周期的影響，結果顯示HT9/sh－3.1－1 細胞的S 期細胞增多，并出現(xiàn)明顯的凋亡峰，HT9 和HT9/sh－3.1 細胞的細胞周期未發(fā)現(xiàn)顯著變化。綜上所述，利用RNA 干擾技術沉默MDR1 基因表達能有效增加多藥耐藥細胞HT9 對三尖杉酯堿的敏感性，增強三尖杉酯堿誘導的HT9 細胞凋亡。

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