張 潔，趙浩亮，賀杰峰，李輝宇

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科，太原030001

原發(fā)性肝癌是世界上最高發(fā)的癌癥之一，早期診斷率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期［1-2］，因此尋求新型有效的抗肝癌藥物具有重要意義。NSC348884是Qi等［3］于2008年首次報(bào)道的一種核磷蛋白 (nucleophosmin，NPM)小分子抑制劑。它能特異性破壞NPM氨基末端的疏水口袋結(jié)構(gòu)，從而抑制NPM寡聚物的形成，破壞其在癌細(xì)胞中的異常功能。該研究表明NSC348884可在多種癌細(xì)胞系中抑制細(xì)胞的增殖，包括前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、淋巴癌。因此，NSC348884將可能成為抗癌治療的新型藥物。最新研究表明，NPM在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中呈高表達(dá)，可能是潛在的HCC標(biāo)志物［4］。NPM將可能成為肝癌治療的新靶點(diǎn)，而關(guān)于NSC348884對肝癌細(xì)胞的作用尚少有報(bào)道。本研究旨在觀察NSC348884對肝癌細(xì)胞HepG2體外生長的抑制效應(yīng)，并探討其作用機(jī)制。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞株 (購自中國科學(xué)院)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(另加入青霉素50 U/ml和鏈霉素60 μg/ml)中，溫度37℃，含5%的CO2，選用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

噻唑藍(lán)檢測細(xì)胞增殖HepG2細(xì)胞以5×104/ml的濃度接種于96孔板中，每孔200 μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后更換NSC348884(美國Sigma公司)終濃度為0、0.01、0.1、1、2、5、10、40、50 μmol/L 的10%胎牛血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 d后，加入噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，4 h后，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜100 μl，培育5 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)組按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:存活率 (%)=加藥細(xì)胞平均吸光度值/對照細(xì)胞平均吸光度值×100%，繪制細(xì)胞增殖曲線圖。

免疫印跡法檢測寡聚物及單體的表達(dá)變化0 μmol/L(空白對照)、2 μmol/L NSC348884 分別處理肝癌細(xì)胞HepG2，24 h后胰酶消化，收集細(xì)胞。按核蛋白提取試劑盒方法提取核蛋白。Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取50 μg蛋白質(zhì)分別做濃度為15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (native polyacrylamide gel electrophoresis，native PAGE)，電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，小牛血清封閉2 h，兔抗人NPM一抗 (CST公司)1∶1000室溫孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (美國Santa Cruz Biotechnology公司)室溫孵育1 h，最后使用二氨基聯(lián)苯胺試劑顯色 (美國DAKO公司)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率0、1、2 μmol/L的NSC348884處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液洗滌，重懸于4℃、70%酒精中固定過夜，離心后加入200 μg/ml RNA酶400 μl 37℃處理30 min，再加入 15 μg/ml碘化丙啶 100 μl 4℃避光處理30 min，流式細(xì)胞儀 (美國Beckman公司)檢測細(xì)胞凋亡率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

NSC348884抑制HepG2細(xì)胞增殖活性MTT結(jié)果顯示，NSC348884在0.01 μmol/L低濃度時(shí)吸光度與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);濃度為0.1 μmol/L 和 1 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率分別為(72.333±5.774)%和 (74.667±4.163)%、二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);當(dāng)濃度在1～10 μmol/L之間時(shí)，明顯抑制了細(xì)胞的生長，濃度為2、5、10 μmol/L時(shí)存活率分別為(35.333±4.041)%、(17.667±2.082)%、(22.333±2.887)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);NSC348884濃度為 40、50 μmol/L時(shí)，存活率分別為 (26.333±1.528)%、(28.000±1.732)%、二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。NSC348884對肝癌細(xì)胞HepG2的半數(shù)抑制濃度 (50%inhibiting concentration，IC50)為 1.4 μmol/L。

NSC348884破壞HepG2細(xì)胞NPM寡聚物結(jié)構(gòu)0 μmol/L 及2 μmol/L NSC348884 處理 HepG2 細(xì)胞24 h后，與0 μmol/L組相比，2 μmol/L組的NPM寡聚物表達(dá)量明顯降低，而單體的表達(dá)量增高 (圖1)。圖像分析結(jié)果顯示，2 μmol/L組寡聚物蛋白條帶灰度比值 (0.289±0.035)明顯低于0 μmol/L組寡聚物蛋白條帶灰度比值 (1.443±0.041)(P＜0.05);而2 μmol/L組單體蛋白條帶灰度比值(1.781±0.101)明顯高于0 μmol/L組單體蛋白條帶灰度比值 (1.122±0.007)(P＜0.05)。

圖1 NSC348884特異性破壞NPM寡聚物結(jié)構(gòu)Fig 1 NSC348884 specifically disrupts NPM oligomer

NSC348884誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡0、1、2 μmol/L NSC348884處理HepG2細(xì)胞24 h后，凋亡率分別為 (6.950±0.207)%、(13.770±0.335)%、(19.021±0.237)%。處理組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05);2 μmol/L與1 μmol/L處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)(圖2)。

討 論

HCC一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多為晚期，對不宜手術(shù)者，化療是主要的治療方法?；熕幬锏淖饔脵C(jī)制很多，而蛋白-蛋白相互作用位點(diǎn)是強(qiáng)有力的干預(yù)靶點(diǎn)，是發(fā)展抗癌藥物的熱點(diǎn)，目前以蛋白-蛋白相互作用位點(diǎn)為靶點(diǎn)的化療藥物的應(yīng)用已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)［5］。

NPM是主要的核仁磷酸化蛋白，其結(jié)構(gòu)特征包括一個(gè)氨基末端保守的寡聚化區(qū)［6-7］，NPM的寡聚化可能是調(diào)節(jié)NPM多種功能的必要步驟［8］。研究表明，NPM在多種實(shí)體腫瘤中存在高表達(dá)，被認(rèn)為是結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物之一［9］。此外，有研究表明Rev蛋白的一個(gè)肽與NPM結(jié)合使Ras轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而抑制裸鼠模型中腫瘤的生長［10］。這是關(guān)于抑制NPM后產(chǎn)生抗腫瘤作用的首次報(bào)道。

圖2 NSC348884誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡Fig 2 NSC348884 induces the apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

基于上述研究，Qi等［3］通過對NPM分子模型三維結(jié)構(gòu)的研究，確定影響其寡聚物形成的藥效基團(tuán)，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)篩選以及相互作用而確定了一種NPM的小分子抑制劑——NSC348884。他們的研究表明NSC348884以1.7～4.0 μmol/L的IC50在多種癌細(xì)胞系中抑制了細(xì)胞的增殖。Yun等［4］的最新研究證實(shí)，NPM在HCC中呈高表達(dá)，且顯著高于非癌肝組織;NPM在HCC中的高表達(dá)與增殖細(xì)胞核抗原水平以及血清甲胎蛋白、肝硬化等臨床預(yù)后參數(shù)相關(guān);NPM可能是潛在的HCC標(biāo)志物。因此，NPM可能是一個(gè)潛在的原癌基因，將可能成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。

本研究應(yīng)用MTT比色法測定NSC348884對HepG2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示NSC348884對肝癌細(xì)胞HepG2生長有抑制作用，藥物濃度在1～10 μmol/L之間時(shí)，對細(xì)胞的抑制作用最明顯，隨藥物濃度增加，細(xì)胞的存活率降低，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。NSC348884的IC50為1.4 μmol/L。隨后通過對不同濃度NSC348884處理組進(jìn)行Native PAGE、SDSPAGE免疫印跡檢測，結(jié)果表明NSC348884能特異性破壞肝癌細(xì)胞HepG2中NPM寡聚物結(jié)構(gòu)，促使其寡聚物轉(zhuǎn)化為單體，這是NSC348884發(fā)揮抗腫瘤作用的分子基礎(chǔ)。

研究表明，NSC348884通過上調(diào)p53(增加15位絲氨酸的磷酸化)，以劑量依賴方式誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡［3］。本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示NSC348884以劑量依賴方式誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的發(fā)生，而有關(guān)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示NSC348884通過促使肝癌細(xì)胞HepG2中NPM寡聚物轉(zhuǎn)化為單體，從而抑制HepG2細(xì)胞的體外增殖，并且可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，而其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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