鄭蘭榮，邵金貴

皖南醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室，安徽蕪湖241002

神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor，NGF)是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它是一種含有118個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由一個(gè)β亞單位、兩個(gè)α亞單位以及兩個(gè)γ亞單位以非共價(jià)鍵結(jié)合形成，其中β亞單位是唯一具有活性的亞基［1］。大量的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)它是周圍神經(jīng)系統(tǒng)交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元及中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)元發(fā)育、分化和行使正常功能必不可少的營養(yǎng)因子［2］。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最大的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)，是比較高級(jí)的軀體運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中樞。但是有關(guān)小腦胚胎發(fā)育階段NGF陽性神經(jīng)元的發(fā)育目前鮮見報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)胚胎發(fā)育時(shí)期小腦內(nèi)NGF陽性神經(jīng)元的發(fā)生、生長發(fā)育、形態(tài)演變及其分布特征進(jìn)行較全面觀察，并檢測(cè)積分吸光度 (integral absorbance，IA)，以探索其生長發(fā)育規(guī)律。

材料和方法

胚胎收集與分組收集合法的發(fā)育正常、已經(jīng)死亡的人胎標(biāo)本29例 (研究經(jīng)倫理委員會(huì)同意，每例標(biāo)本的收集均經(jīng)產(chǎn)婦本人同意并簽署知情同意書)，根據(jù)測(cè)量其頂臀長，按Patten法［3］并結(jié)合其母體末次月經(jīng)日期推算胎齡，以每4周為一月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下:第3個(gè)月齡(9～12周)組4例，第4個(gè)月齡 (13～16周)組4例，第5個(gè)月齡 (17～20周)組5例，第6個(gè)月齡(21～24周)組6例，第7個(gè)月齡 (25～28周)組4例，第8個(gè)月齡 (29～32周)組6例。

取材和切片(1)開顱，沿胎尸左側(cè)小腦半球同一部位垂直于小腦表面切取一組織塊，于10%的甲醛水溶液中固定24 h;(2)梯度酒精脫水; (3)二甲苯通明:二甲苯1、2分兩次各5 min的通明;(4)浸蠟:浸入70℃的蠟1 h;(5)包埋:用70℃蠟包埋，使包埋塊于室溫下自然冷卻凝固;(6)切片:用組織切片機(jī)進(jìn)行切片，每片厚5 μm，切片裱于涂有0.5%明膠的載片上，并放入60℃烤箱內(nèi)烤1 h。

免疫組織化學(xué)染色常規(guī)脫蠟至水，3%的H2O2蒸餾水溶液孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化酶，將切片入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液 (pH 6.0)加熱至沸騰后斷電，5 min后再重復(fù)1次，自然冷卻至室溫，抗原修復(fù)液孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉液孵育30 min，傾去封閉液，滴加兔抗nNOS血清 (1∶100)，4℃過夜，滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗 (羊抗兔IgG抗血清)孵育20 min，滴加即用型鏈霉素親霉素酶復(fù)合物 (strept avidin-biotin complex，SABC)，孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine，DAB)-H2O2染色液顯色，以上各步之間均用緩沖液浸洗3遍，每遍5 min。顯微鏡下控制顯色反應(yīng)時(shí)間，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)終止顯色，蒸餾水洗后，常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡觀察。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)用 PBS替代一抗、二抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性片作為陽性對(duì)照。

結(jié)果判定和圖像分析切片經(jīng)染色后，NGF陽性神經(jīng)元的胞膜和胞質(zhì)呈黃色或黃褐色，細(xì)胞核不著色。用 NISDR專業(yè)圖像處理分析軟件 (日本Nikon)測(cè)定某一視野下NGF陽性染色細(xì)胞的IA，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，對(duì)每份樣本4張切片的3個(gè)視野陽性染色細(xì)胞的IA值取平均值，組間比較采用單因素方差分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用 SPSS 11.15統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

結(jié) 果

HE染色HE染色有助于辨認(rèn)小腦皮質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，但不能辨認(rèn)NGF陽性神經(jīng)元 (圖1)。

免疫組織化學(xué)觀察用PBS替代一抗、二抗進(jìn)行的免疫組織化學(xué)對(duì)照實(shí)驗(yàn)均未見NGF陽性神經(jīng)細(xì)胞 (圖2)。第3個(gè)月齡時(shí)，在小腦的室管層、中間層和邊緣層均可見NGF陽性反應(yīng)神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體為圓形，大小不一，呈散在分布，神經(jīng)元的一端或兩端帶有突起，有的突起較長，小腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨嗜細(xì)胞都出現(xiàn)典型的NGF強(qiáng)陽性物質(zhì)(圖3A)。第4個(gè)月齡時(shí)，室管層NGF陽性神經(jīng)元胞體呈圓形，胞質(zhì)少，核漿比大于1，在神經(jīng)元的一端或兩端見突起，中間層可見NGF陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維分布，有的神經(jīng)元胞體比室管層神經(jīng)元胞體大，胞質(zhì)相對(duì)增多，染色加深;邊緣層NGF陽性神經(jīng)元胞體較小，呈圓形或梭形，神經(jīng)突起明顯 (圖3B);外顆粒層未見NGF陽性神經(jīng)元。第5個(gè)月齡時(shí)，室管層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，胞體較小，呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)相對(duì)增多，突起伸長，蒲肯野細(xì)胞層呈NGF陽性表達(dá)，邊緣層可見NGF陽性神經(jīng)元胞體呈圓形或梭形，染色較深，有的神經(jīng)元突起較長，有的較短，有的神經(jīng)元有多個(gè)神經(jīng)突起 (圖3C)。第6、7個(gè)月齡時(shí)，蒲肯野細(xì)胞胞體增大，胞質(zhì)增多，NGF染色加深，在神經(jīng)元之間形成較密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)，邊緣層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，胞體較小，呈圓形或橢圓形 (圖3D、3E);內(nèi)顆粒層NGF陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量和大小與第5個(gè)月齡相似;外顆粒層未見NGF陽性神經(jīng)元。第8個(gè)月齡時(shí)，蒲肯野細(xì)胞胞體呈圓形或梨形，每個(gè)蒲肯野細(xì)胞都向分子層伸出多個(gè)粗大突起纖維，NGF陽性反應(yīng)較強(qiáng);分子層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，胞體較小，呈圓形，染色較深;顆粒細(xì)胞層NGF陽性神經(jīng)元胞體較小，呈圓形，細(xì)胞質(zhì)少，呈NGF陽性反應(yīng)(圖3F)。

IA值結(jié)果第3～8個(gè)月齡段IA值逐漸升高，且每兩個(gè)月齡組IA值之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.05)(表1)，提示NGF在人胎小腦皮質(zhì)神經(jīng)元的陽性表達(dá)呈現(xiàn)由少到多的規(guī)律。

圖1 第3個(gè)月齡人胚胎小腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果 (×400)Fig 1 HE staining results of cerebellar cortex of human fetus at the third month of gestation(×400)

圖2 人胚胎小腦皮質(zhì)免疫組化染色陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (×400)Fig 2 Negative control immunohistochemisty of experiment results of cerebellar cortex of human fetus(×400)

表1 NGF在不同胎齡小腦皮質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)的積分吸光度Table 1 Expression of NGF in the cerebellar cortical neurons of different gestational ages quantified by integral absorbance

討 論

胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生，起源于脊索背面外胚層增厚的神經(jīng)板，神經(jīng)板凹陷形成神經(jīng)溝，神經(jīng)溝兩側(cè)高起的神經(jīng)褶逐漸靠攏并聯(lián)合，形成神經(jīng)管，神經(jīng)管的頭端部分發(fā)育形成大腦、中腦、丘腦和小腦等。1970年Boulder神經(jīng)科學(xué)會(huì)建議把分化中的神經(jīng)管壁細(xì)胞分為4層:室管層、室管下層、中間層、邊緣層。小腦皮質(zhì)的神經(jīng)元最初來源于室管層，室管層細(xì)胞經(jīng)過不斷分裂、增殖、遷移形成了中間層和邊緣層。小腦的組織發(fā)生有別于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他部分，因?yàn)樵谛∧X表面有一個(gè)次級(jí)增殖區(qū)，這個(gè)次級(jí)增殖區(qū)即為外顆粒層。它是自神經(jīng)上皮層發(fā)生的一些細(xì)胞通過邊緣層遷移到小腦表面下方，這層細(xì)胞被認(rèn)為是移位的神經(jīng)上皮細(xì)胞，仍保持分裂能力。胚胎第6個(gè)月齡時(shí)，自外顆粒層釋放出NGF陽性神經(jīng)細(xì)胞，向正在分化的蒲肯野細(xì)胞深層方向遷移，依次形成小腦的顆粒細(xì)胞、高爾基細(xì)胞和筐籃細(xì)胞［4］。

圖3 第3～8個(gè)胎齡人胚胎小腦皮質(zhì)中NGF陽性神經(jīng)元細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果 (SABC，×400)Fig 3 Immunohistochemisty of NGF-positive neurons in the ependymal layers of the cerebellum at the third to tenth month of gestation(SABC，×400)

NGF是一種蛋白類多肽，在生物體內(nèi)廣泛分布，中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及唾液腺、前列腺等都可以合成并分泌，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促進(jìn)神經(jīng)元突起生長雙重生物學(xué)功能［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)在胚胎第3個(gè)月齡時(shí)，小腦室管層、中間層和邊緣層均可見NGF陽性神經(jīng)元，形態(tài)特征是:胞體較小，胞質(zhì)少，說明該月齡小腦內(nèi)NGF活性較低，是NGF陽性神經(jīng)元分化形成的早期階段。并且在該月齡時(shí)可見小腦血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)NGF陽性反應(yīng)物質(zhì)，提示NGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管發(fā)生具有重要的意義。第4個(gè)月齡時(shí)，小腦初步分化為表面的皮質(zhì)和中央的白質(zhì)，胚胎早期的小腦皮質(zhì)從表面向深部依次分為外顆粒層、邊緣層、中間層和室管層。中間層NGF陽性細(xì)胞是小腦皮質(zhì)發(fā)育、增厚和分化、遷移的主要細(xì)胞。本研究觀察到，第4個(gè)月齡時(shí)，中間層NGF陽性神經(jīng)元胞體較大，胞質(zhì)較多，神經(jīng)元之間出現(xiàn)NGF陽性神經(jīng)纖維，表明該月齡中間層NGF陽性神經(jīng)元合成和釋放NGF的能力增強(qiáng)，使得小腦中間層局部NGF濃度升高，可能高濃度的NGF對(duì)小腦各種細(xì)胞的增殖、分化、遷移、生長具有重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在胚胎發(fā)育期，NGF可誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長，刺激胞體和樹突的發(fā)育，促進(jìn)神經(jīng)元的分化和纖維的延長［7-9］。本研究結(jié)果表明，第5～7月齡時(shí)，室管層和邊緣層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)目迅速增多，同時(shí)蒲肯野細(xì)胞NGF陽性逐漸增強(qiáng)，胞體變大，突起增粗伸長。從HE染色切片上看，這一時(shí)期也是小腦皮質(zhì)迅速增厚、各種細(xì)胞由內(nèi)向外和或由外向內(nèi)大遷移的時(shí)期，進(jìn)一步表明NGF不僅對(duì)NGF陽性神經(jīng)元自身的生長發(fā)育，而且對(duì)小腦其他類型細(xì)胞的生長發(fā)育都具有重要作用。根據(jù)本研究的觀察，第8個(gè)月齡時(shí)，小腦皮質(zhì)3層結(jié)構(gòu)已初具雛形，蒲肯野細(xì)胞及其他類型的NGF陽性神經(jīng)元已基本發(fā)育成熟。

在胚胎第3～8個(gè)月齡時(shí)，IA值呈現(xiàn)逐月升高的趨勢(shì)，提示這6個(gè)月內(nèi)NGF在人胎小腦皮質(zhì)各層均有陽性表達(dá)，且由弱到強(qiáng)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，這些表明NGF不僅對(duì)該階段人胚胎小腦皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)纖維起到誘導(dǎo)發(fā)育生長的關(guān)鍵作用，對(duì)蒲肯野細(xì)胞等其他類型細(xì)胞的生長發(fā)育也有一定的重要作用。

總之，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果及IA值測(cè)量結(jié)果均表明，在人胚胎小腦皮質(zhì)發(fā)育過程中，NGF在皮質(zhì)中的表達(dá)呈由弱到強(qiáng)的變化規(guī)律，由此表明NGF在人胚胎小腦皮質(zhì)的生長發(fā)育過程中起重要的作用。

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