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妥布霉素生物合成中磷酸鹽的調(diào)節(jié)研究

2012-09-18 06:57:32
中國(guó)醫(yī)藥指南 2012年13期
關(guān)鍵詞:肌醇氯霉素磷酸鹽

劉 平

(丹東市食品藥品檢驗(yàn)所,遼寧 丹東 118002)

在慶大霉素生物合成過(guò)程中,高濃度磷酸鹽阻遏從葡萄糖至2-DOS(2-脫氧鏈霉胺)之間的轉(zhuǎn)氨酶,從而影響產(chǎn)抗單位[1]。

妥布霉素(Tobramycin)屬第二代氨基糖苷類(lèi)抗生素,作用于細(xì)菌30S核糖體亞基,抑制菌體蛋白質(zhì)的合成,是廣譜高效力抗生素,在體外對(duì)多種細(xì)菌具有抗菌的活性,特別是對(duì)某些慶大霉素耐藥的綠膿桿菌活性更為顯著[2]。妥布霉素是黑暗鏈霉菌(S.tenebrariuys)發(fā)酵液中分離到的尼拉霉素(Nebramycin)復(fù)合物中的一個(gè)組分。尼拉霉素復(fù)合物其中主要組分為2、4、5′三個(gè)組分。組分5′為6”-O-氨甲酰妥布霉素(6”-O-Carbamoyltobramycin,CTB)。組分6(妥布霉素)可分別由組分4和組分5′經(jīng)水解制得[3]。目前,國(guó)內(nèi)妥布霉素產(chǎn)生菌主要產(chǎn)生組分2和組分5′兩個(gè)組分,由于提取、精制的步驟復(fù)雜,成本較高。為了提高菌株生產(chǎn)能力,降低妥布霉素生產(chǎn)成本,很多人已經(jīng)在菌種選育方面作了大量工作,但是對(duì)于CTB生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制研究很少,本文初步探討了磷酸鹽調(diào)節(jié)CTB生物合成的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑暗鏈霉菌201-420(S.tenebrariuys201-420),總效價(jià)1143U/mL,CTB百分含量88.5%;檢定菌:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 63501)。

1.2 培養(yǎng)基(%)

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

高氏一號(hào)種子培養(yǎng)基:葡萄糖1.0,黃豆粉1.0,蛋白胨0.3,玉米粉0.5,酵母粉0.1,CaCO30.1。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

黃豆粉4.0,葡萄糖4.0,蛋白胨1.0,CaCO30.5,MgSO4?7H2O 0.4,MnCl20.03,F(xiàn)eSO40.005,ZnSO40.003,NH4Cl 0.1%,豆油1.0。

1.2.3 鑒定培養(yǎng)基

蛋白胨0.5,牛肉膏0.3,K2HPO4 0.3,瓊脂2.2,pH 7.8~8.0。

1.3 效價(jià)測(cè)定方法

二劑量法(中國(guó)藥典2005年版)

1.4 細(xì)胞破碎方法

將發(fā)酵液離心收集菌體,洗滌,置-70°C冰箱反復(fù)凍融3次,用超聲波破碎儀破碎菌體。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 37h補(bǔ)加磷酸鹽對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響

見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,37h補(bǔ)加低濃度磷酸鹽時(shí),有促進(jìn)產(chǎn)生抗生素的作用,而當(dāng)最終的作用濃度達(dá)到0.1%以上的時(shí)侯,效價(jià)就會(huì)顯著下降。磷酸鹽對(duì)各種抗生素合成的調(diào)節(jié)有不同的機(jī)制。所以,在下面的實(shí)驗(yàn)中,作者考察了磷酸鹽調(diào)節(jié)CTB生物合成一種可能的機(jī)制。

2.2 高濃度磷酸鹽阻遏從2-脫氧肌醇到2-DOS之間的轉(zhuǎn)氨酶2-DOS是氨糖類(lèi)抗生素重要的生物合成中間體,從葡萄糖至2-DOS的生物合成途徑中,如圖2,葡萄糖首先轉(zhuǎn)變成為2-脫氧肌醇,然后再經(jīng)過(guò)兩次氧化、氨基化作用,轉(zhuǎn)變成為2-DOS[4]。根據(jù)報(bào)道,在慶大霉素生物合成的過(guò)程中,高濃度的磷酸鹽阻遏了從葡萄糖到2-DOS之間的L-谷氨酰胺:青蟹-肌醇單酮轉(zhuǎn)氨酶。因而影響氨基化作用,進(jìn)而影響產(chǎn)生抗生素[3]。在以下的實(shí)驗(yàn)中,我考察了在CTB的生物合成過(guò)程中是否也存在相同的作用機(jī)制。

圖1 37h補(bǔ)加磷酸鹽對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響

2.3 高濃度磷酸鹽與氯霉素作用效果比較為了考察高濃度磷酸鹽的負(fù)調(diào)控作用是通過(guò)阻遏某種酶的合成還是抑制某種酶的活性,我比較了高濃度的磷酸鹽與氯霉素的作用效果,因?yàn)槁让顾厥堑鞍踪|(zhì)合成抑制劑,發(fā)酵37h,同時(shí)向發(fā)酵液中添加一定濃度的氯霉素和高濃度的磷酸鹽,若兩者對(duì)CTB生物合成的作用效果一致,則表明磷酸鹽是通過(guò)阻遏某種酶的合成而影響抗生素的合成。結(jié)果如圖2所示。由圖2中可以看出,氯霉素對(duì)菌體的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。可氯霉素和高濃度磷酸鹽對(duì)CTB生物合成的作用效果基本一致,這表明磷酸鹽是通過(guò)阻遏CTB生物合成過(guò)程中的某個(gè)酶的合成而起作用的。

圖2 高濃度磷酸鹽與氯霉素作用效果比較

2.4 高濃度磷酸鹽阻遏從2-脫氧肌醇到2-DOS之間的轉(zhuǎn)氨酶 為了考察磷酸鹽具體阻遏了CTB生物合成過(guò)程中哪一個(gè)步驟,我在發(fā)酵37hr,向發(fā)酵液中添加11.6 mmol/L的磷酸鹽,使抗生素的合成被抑制,并且在發(fā)酵73h,加入不同濃度由葡萄糖到2-DOS之間幾種可能的前體物質(zhì)或中間體。由表1看出:只有73h,加入30mmol/L以上的氨基葡萄糖。由此,可以推測(cè)同慶大霉素一樣磷酸鹽阻遏了。

表1 Specific antibiotic produced by phosphate repress cultures supplementedwith precursors and intermediates of the CTB biosynthetic pathway

3 結(jié) 論

通過(guò)上面的實(shí)驗(yàn),我們可以得出下面的結(jié)論:在發(fā)酵過(guò)程中加入5.75mmol/L以上磷酸鹽,對(duì)CTB的生物合成發(fā)生明顯的負(fù)調(diào)控作用。其原因可能是:磷酸鹽本身阻遏L-谷氨酰胺:青蟹-肌醇單酮轉(zhuǎn)氨酶的合成。從而影響了從葡萄糖合成2-DOS的氨基化作用。

[1] Obregon AM.Physioloical studies on getamicin:Phosphate repression of antibiotic formation[J].J Antibiotics,1994,47(12):1442-1446.

[2] 張淑華,李蓉以,廖勇.國(guó)產(chǎn)妥布拉霉素和阿普拉霉素對(duì)綠膿桿菌體外抗菌活力的研究[J].抗生素,1986,11(3):239.

[3] Koch,K.Nebramycin:seperation of the complex and identification of factor 4,5and 5’,J[J].Antibiotics,1973,26(12):745-751.

[4] Rinehart KL Jr,Malik JM,Nystrom RF,et al.Biosynthetic incorporation of [1-13C] glucosamine(*)and [6-13C] glucose into neomycin,J[J].Am Chem.Soc,1974,96(5495):2263-2265.

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