鄧 波，劉佩紅，周錦萍＊，王 建，劉 健，鞠厚斌，葛菲菲，崔 立，華修國

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.上海交通大學 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240）

博卡病毒（Boka virus，BoV）屬于細小病毒科，而細小病毒科屬于最小、最簡單的一類單鏈線狀DNA病毒，包括感染鳥類和哺乳動物的細小病毒亞科和感染節(jié)肢動物的濃核病毒亞科2個亞家族。細小病毒亞科又包括5個屬，即細小病毒屬、紅病毒屬、依賴性病毒屬、貂阿留申病毒屬和博卡病毒屬[1]。

Blom strom A等[2]利用隨機多重置換擴增方法 （random multiple displacement amplification，MDA）在患仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬淋巴結(jié)中擴增出了一段長1879bp的核苷酸序列，該段序列與已知病毒序列比較，發(fā)現(xiàn)其完整的NP1基因及部分VP1／VP2基因與人類博卡病毒相近，故將該病毒暫時定義為豬博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）。PBoV在病豬體內(nèi)被檢出，暗示其對豬有一定的致病性。翟少倫等[3]于2010年建立一種檢測PBoV的PCR方法。

實時熒光定量PCR（Real－time fluorescent quantitative PCR，Real－time PCR）具有較高的特異性、靈敏度，以及可定量、有效解決PCR污染問題及自動化程度高等優(yōu)點，在醫(yī)學、微生物和動植物檢疫方面得到廣泛應用[4－6]。本研究目的在于建立Taq Man探針實時熒光定量PCR方法用于檢測PBoV。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性樣品來源 陽性樣品由上海交通大學上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室提供，按照參考文獻[3]進行PCR檢測，并將產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序后通過NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比對。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Agarose LE，Genebase Gene－Tech公司產(chǎn)品；6×loading buffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)大腸埃希菌，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設計和篩選 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Bocavirus 5′端非編碼區(qū)的保守核苷酸序列 VP1／2區(qū)域，采用軟件 Primer Express 2.0（ABI公司）設計引物和Taq Man熒光探針序列，并通過NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性比對驗證（登錄號：FJ872544），篩選獲得的引物和探針如下：

PBo－F1：5＇TCAGAGATCGAGCTATACAACCG3＇；PBo－R2：5＇CTGTTTCGGAGATGTCCTTGC3＇；PBo－Probe：5＇－FAM－AGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCCT－BHQ－3＇；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務公司合成，Taq Man探針由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司合成，PAGE純化。擴增目標片段長度為85bp。

1.2.2 病毒DNA的抽提和模板的制備 病毒DNA的抽提選用血液病毒DNA快速提取試劑盒（LG－0105A），上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化、連接和轉(zhuǎn)化，將擴增產(chǎn)物克隆到pGEMT－Vector載體中，構(gòu)建陽性質(zhì)粒。提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，并送至上海生工生物技術(shù)工程服務公司測序，并與GenBank中已知序列進行比較。

1.2.3 PBoV實時熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化 擴增反應體系如下：10×擴增緩沖液6μL，4種dNTP混合物各200μmol／L，模板DNA2μL，Taq DNA聚合酶2U／μL，UNG酶Tris－HCl pH 8.6緩沖液5U／100μL，加雙或三蒸水至30μL。按下列反應參數(shù)進行擴增：94℃5min，94℃，15s，60℃40 s，40個循環(huán)。

確定反應體系后，比較 Mg2＋濃度分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mmol／L下，引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2μmol／L下，探針終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol／L 下的PCR擴增效果，選擇最適濃度[7]。每次檢測時，設置陰性對照（健康豬的基因組DNA）和水為模板的空白對照；在陰性對照和陽性對照均成立時，整個試驗有效，可判定結(jié)果[8]。

1.2.4 特異性試驗 利用建立的實時熒光定量PCR反應體系，擴增臨床保存的15例SPF豬血清、5份豬細小病毒（PPV）陽性、5份豬藍耳病病毒（PRRSV）陽性、5份豬圓環(huán)病毒（PCV）陽性病料標本，檢測其特異性。

1.2.5 靈敏度試驗 提取DNA質(zhì)粒，然后分級10倍稀釋成1×1010copies／μL～100copies／μL，分別取每一數(shù)量級稀釋液2μL作為PCR模板。在PCR的過程中由實時熒光定量PCR儀自動繪制線性標準曲線。按照參考文獻[3]進行常規(guī)PCR，產(chǎn)物大小為496bp，比較兩種方法靈敏度的差異。

1.2.6 重復性試驗 以相同稀釋度質(zhì)粒作為模板，10倍梯度稀釋成3個不同梯度模板，重復10次反應。并取質(zhì)粒和陰性血清稀釋液，提取核酸，重復多孔同步檢測，考察重復性[9]。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 將檢測試劑放入4℃冰箱中及37℃恒溫箱中進行加速破壞試驗，連續(xù)監(jiān)測7d反應試劑檢測性能的變化，從而判斷反應體系的穩(wěn)定性。1.2.8 標準曲線的建立 將101copies／μL～107copies／μL系列核酸樣品設為標準品，以各標準品的拷貝數(shù)值為X軸，以Ct值為Y軸構(gòu)建定量標準曲線。

2 結(jié)果

2.1 反應條件的優(yōu)化

結(jié)果表明，不同Mg2＋濃度、引物和探針終濃度對結(jié)果影響較大，經(jīng)篩選后確定 Mg2＋濃度為3.5 mmol／L、引物濃度為0.2μmol／L和探針濃度0.2 μmol／L。各反應條件優(yōu)化后，每次檢測的陰性對照和空白對照無Ct值，無擴增曲線。陽性對照的Ct值均小于31.00，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，陽性對照擴增曲線基本上是重合的。

2.2 特異性試驗結(jié)果

特異性結(jié)果顯示，只有PBoV出現(xiàn)擴增曲線，Ct值分別為29.48和30.01，判為陽性。而其他病原和陰性對照均為陰性，表明建立的方法有較好的特異性（圖1、圖2）

圖1 15例SPF豬血清標本實時熒光PCR檢測擴增圖Fig.1 Amplification curves of 15SPF serum sample templates

圖2 15例組織樣品PBoV R普通PCR檢測陰性標本實時熒光PC檢測擴增圖Fig.2 Amplification curves of 15negative sample templates

2.3 靈敏度試驗結(jié)果

本試驗可檢測107copies／μL～101copies／μL病毒載量，區(qū)別于陰性對照的最低模板濃度即靈敏度為101copies／μL，即將質(zhì)粒以10倍倍比稀釋至濃度極限102copies／μL，多次重復試驗測得實時熒光定量PCR反應系統(tǒng)的檢測最低限度為101DNA拷貝每30μL反應體系（圖3）。

同時用普通PCR方法和熒光定量PCR方法對上海及周邊地區(qū)122份豬臨床內(nèi)臟樣本進行豬博卡病毒檢測（表1）。結(jié)果表明有4份樣品熒光定量PCR方法檢測為陽性，而普通PCR方法檢測為陰性。將4份陽性產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序后通過NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，同源性均在97%以上。

圖3 從左至右分別為107copies／μL～101copies／μL八個不同濃度豬博卡陽性質(zhì)粒標準品的熒光曲線Fig.3 From left to right：Amplification curves of（107copies／μL ～101copies／μL）PBoV plasmid templates

2.4 重復性試驗

如表2結(jié)果所示，所有稀釋梯度下變異系數(shù)均在0.25%～0.54%左右，遠小于其他研制試驗報道[10]的變異系數(shù)（CV）6.66%和6.84%，表明本檢測系統(tǒng)對陽性質(zhì)粒檢測的重復性較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

如表3、表4與圖4、圖5所示，4℃試驗中PBoV－1、PBoV－2和PBoV－3變異系數(shù)分別為1.38%、5.44% 和 3.79%。37℃試驗中分別為2.37%、1.71%、5.61%。4℃和37℃試驗7d連續(xù)檢測后分析結(jié)果，其變異系數(shù)2%～5%左右，從試驗結(jié)果可見，檢驗體系具有良好的穩(wěn)定性。

表1 兩種方法對博卡病毒檢測結(jié)果的比較Table1 The comparison results of two detection methods for PBoV

表2 重復性分析Table2 Repeatability analysis

表3 4℃穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table3 Stability test results at 4℃

表4 37℃穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table4 Stability test results at 37℃

圖4 4℃穩(wěn)定性定量結(jié)果分析Fig.4 Stability quantitative analysis at 4℃

圖5 37℃穩(wěn)定性定量結(jié)果分析Fig.5 Stability quantitative analysis at 37℃

2.6 定量標準曲線的建立

將稀釋的DNA設為標準樣品，建立標準曲線（圖6）。由圖可知，曲線斜率為－3.857，模板濃度在107～101范圍內(nèi)有較好的線性關系，相關系數(shù)為0.997。在對送檢樣品進行檢測時，可根據(jù)獲得的Ct值和標準曲線計算該樣品所含病毒數(shù)量，但所檢測到的只是病毒的DNA拷貝數(shù)，而非具有感染性的病毒顆粒。

圖6 Real－time PCR 標 準曲線Fig.6 The standard curve for real－time PCR

3 討論

豬博卡病毒是最新發(fā)現(xiàn)的一種DNA病毒，為了及時地評估其在我市的流行情況，本研究根據(jù)GenBank上遞交的惟一一條豬博卡病毒核苷酸序列設計了一對特異性引物，并建立了豬博卡病毒的熒光定量PCR檢測方法。Taq Man熒光探針法具有快速、特異性高、操作簡便、重復性好、一次試驗可以同時檢測大批量樣本等優(yōu)點。試驗所用的Taq Man技術(shù)對于整個試驗的擴增檢測都是在一個密閉體系中進行的，減少了擴增體系本身以及其對實驗室環(huán)境的污染[3]。本試驗建立的實時熒光定量PCR方法可以作為豬博卡病毒在臨床上的一種診斷技術(shù)。

本方法靈敏度檢測限度為101copies／μL；特異性方面，在對30例陰性標本的檢測中未出現(xiàn)一例假陽性。穩(wěn)定性試驗，4℃試驗中PBoV－1，PBoV－2，PBoV－3變異系數(shù)分別為1.38%，5.44%，3.79%。37℃試驗中PBoV－1，PBoV－2，PBoV－3變異系數(shù)分別為2.37%、1.71%、5.61%4℃和37℃試驗7d連續(xù)檢測后分析結(jié)果，其變異系數(shù)2%～5%左右，從試驗結(jié)果可見，本方法具有良好的穩(wěn)定性。

綜上所述，本試驗所建立的實時熒光定量PCR檢測的方法，具有靈敏度高，特異性好，在對豬博卡病毒株的基因診斷中具有廣泛的臨床應用前景，適合做大規(guī)模臨床樣本的檢測。

[1]Tattersall P，Bergoin M，Bloom M E，et al.Family Parvoviridae[M].／／Fauquet CM，MayoMA，ManiloffJ，et al.Virus taxonomy：classification and nomenclature of viruses.Eighthreport of the International Committee on the Taxonomy of Viruses.London，United Kingdom：Elsevier Academic Press，2005：353－369.

[2]Blomstrom A，Belak S，F(xiàn)ossum C，et al.Detection of a novel porcine boca－like virus in the background of porcine circovirus type 2induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Virus Res，2009，146：125－129.

[3]翟少倫，岳 城，韋祖樟，等.豬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其應用[J].中國動物傳染病學報，2010，18（2）：14－17.

[4]Balka G，Hormyak A，Balint A，et al.Development of a onestep real－time quantitative PCR assay based on primer－probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Virol Meth，2009，158（1）：41－45.

[5]Dina J，Nguyen E，Gouarin S，et al.Development of duplex realtime PCR for detection of two DNA respiratory viruses[J].J Virol Meth，2009，162（1－2）：119－125.

[6]張 賀，李 波，周 虛，等.實時熒光定量PCR技術(shù)研究進展及應用[J]，動物醫(yī)學進展，2006，27（S）：5－12.

[7]Yancy H F，Washington J D，Callahan L，et al.Development，e valuation，and peer verification of a rapid real－time PCR method for the detection of animal material[J].J Food Prot，2009，72（11）：2368－2374.

[8]范 晴，謝芝勛，劉加波，等，牛病毒性腹瀉病毒實時熒光RT－PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2010，31（10）：10－14.

[9]Andre L，Hamel M.Rapid detection of bovine viral diarrhea vi－rus by using RNA extracted directly from assorted specimens and one－tube reverse transcription PCR assay[J].J Clinical Microbiol，1995，33（2）：287－291.

[10]Allander T，Jartti T，Gupta S，et al.Human bocavirus and acute wheezing in children[J].Clin Infect Dis，2007，44（7）：904－910.