葉成玉，王光華，蔡其剛，王戈平，陸 艷，張芳芳，馬利青，周繼章＊

（1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 ，青海 西寧 810016；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV），也稱牛病毒性腹瀉－黏膜病病毒，與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、羊邊界病毒（Border disease virus，BDV）同屬黃病毒科、瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，整個基因組大小約為12.5kb，包含有一個大的開放閱讀框和兩側(cè)的非編碼區(qū)[1]。開放閱讀框編碼一個近4000個氨基酸的多聚蛋白（E2的克隆與序列分析），從 N端到C端的順序為：Npro（p20）、EC（p14）、E0（gp48）、E1（gp25）、E2（gp53）、p7、NS 2－3（p125）、NS 4A（p10）、NS 4B（p32）、NS 5A（p58）、NS 5B（p75），其中 EC、E0、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白，其他的為非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白主要位于BVDV基因組5′－N端部分。其中E0、E1和E2是糖基化蛋白，而E0、E2為保護性抗原基因，其中結(jié)構(gòu)蛋白E2是牛病毒性腹瀉病毒主要的保護性抗原，具有中和表位，能誘導(dǎo)中和性抗體的產(chǎn)生，具有較強的免疫原性，可以用于研究基因工程亞單位疫苗[3]，但E2是BVDV結(jié)構(gòu)蛋白中變異率較高的一種蛋白，抗原逃逸及突變頻率較高，是導(dǎo)致疫苗保護失效和牛持續(xù)性感染的主要原因[4]。E0是BVDV編碼蛋白中保守性很高的蛋白，其上有中和表位，產(chǎn)生的中和抗體具有中和BVDV和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的能力[5]，因此，它可用于研究基因工程亞單位疫苗及基因工程診斷抗原。目前，國內(nèi)外針對牦牛源BVDV E0基因的研究報道較少[6]。本研究以青海發(fā)病牦牛中分離出的BVDV流行株為試驗材料，克隆表達了BVDV QHZK株的E0基因，為進一步研究BVDV E0蛋白的生物學(xué)活性，制備基因工程診斷抗原奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、IPTG、ExTaq酶、pMD18－T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker，DL2000DNA Marker，T4 DNA連接酶，氨芐青霉素，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；BVDV標準參考株、陰陽性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗牛IgG，購自Sigma公司。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 pMD18－T－E0質(zhì)粒，由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室構(gòu)建并保存；DH5α菌株，購自寶生物工程（大連）有限公司，Rosetta菌株，購自北京全式金生物科技有限公司，原核表達載體pET－32a，由本實驗室保存。

1.1.3 毒株 分離自青海省澤庫縣某牧戶疑似牦牛病毒性腹瀉病牛的樣品，毒株命名為“QHZK10”，由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 BVDV E0基因生物信息學(xué)分析 采用DNA Star軟件分析BVDV牦牛分離株E0基因的二級結(jié)構(gòu)、親水性，并將其抗原性與NADL、C24V毒株進行比較。

1.2.2 E0基因的擴增引物序列為：PF15′－CCCGAATTCATGGAGAACATAACACA －3′，PF25′－CCCCTCGAGTTATGCATATGCCCC －3′。反應(yīng)條件及體系：按照RT－PCR試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系（25μL），10×RT－PCR buffer 2.5μL，dNTP mixture（2.5mmol／L）4.0μL，RNase inhibitor（40 U／μL）1.0μL，上下游引物（0.1μmol／L）各1μL，AMV reverse transcriptase（5U／μL）0.5μL，Taq polymerase（5U／μL）0.5μL，總 RNA （1μg／μL）2.0μL，DEPC水12.5μL。PCR反應(yīng)條件為：45℃30min；95℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL PCR產(chǎn)物以5V／cm恒定電壓于10g／L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.3 E0基因的純化及克隆 用膠回收試劑盒純化BVDV QHZK株E0基因PCR產(chǎn)物，將純化后的產(chǎn)物與pMD18－T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α菌株，經(jīng)氨芐青霉素、X－gal篩選，挑取白色菌落接種于5 mL含氨芐青霉素（終濃度50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h之后提取質(zhì)粒。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET－32a－E0的構(gòu)建 將pET－32a原核表達載體和pMD18－T－E0克隆質(zhì)粒分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，用膠回收試劑盒回收具有黏性末端的E0基因和pET－32a原核表達載體，在T4DNA連接酶作用下16℃連接5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。酶切反應(yīng)總體積60μL，10×buffer 6μL，EcoRⅠ（10U／μL）3μL，XhoⅠ（10 U／μL）3μL，重組質(zhì)粒（50ng／μL）48μL，各成分加入PCR管后放于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)，酶切2h后用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

連接反應(yīng)總體積25μL，體系為：10×T4DNA ligase buffer 2.5μL，E0基因片段10μL，酶切處理的pET－32a載體5μL，T4DNA ligase 1μL，無菌水6.5μL。將各管混勻后，封口膜封口，16℃水浴，連接過夜。

1.2.5 重組質(zhì)粒的鑒定 將5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞 Rosetta（DE3）中，經(jīng)IPTG／X－gal瓊脂平板藍白菌落篩選，隨機挑選白色菌落用含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及PCR鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET－32a－E0。

1.2.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達、蛋白純化與抗原性檢測 取50μL陽性克隆菌液加入到5mL含50μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r／min振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶50增菌于含氨芐青霉素（50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至吸光度OD600nm為0.6～1.0之間，取出1mL未誘導(dǎo)菌液做陰性對照，4℃保存。余者加入IPTG至終濃度1mmol／L，200r／min、37℃誘導(dǎo)表達4h收集菌液，取1mL于1.5mL的離心管中，6000r／min離心3min，棄上清，收集菌體。用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）檢測表達產(chǎn)物，表達的蛋白用His－Band鎳柱進行親合層析純化，并對表達出的蛋白用Western blot試驗進行抗原性檢測。

2 結(jié)果

2.1 E0基因生物信息學(xué)分析

圖1為BVDV QHZK、VEDEVAC和C24V株E0蛋白氨基酸抗原指數(shù)比較圖，圖2是BVDV QHZK、VEDEVAC和C24V株E0蛋白氨基酸親水性比較圖，圖1和圖2總體表明E0氨基酸的抗原性與親水性指數(shù)呈平行相關(guān)性，QHZK株E0氨基酸的抗原性與親水性指數(shù)與標準毒株VEDEVAC和C24V非常相似，從而證明E0基因在BVDV各毒株間具有很高的保守性，有利于研究該病的基因工程疫苗。

圖1 BVDV QHZK、VEDEVAC和C24V株E0蛋白氨基酸抗原指數(shù)比較Fig.1 Compaison of amino acid antigencity of QHZK with VEDEVAC and C24V

圖2 BVDV QHZK、VEDEVAC和C24V株E0蛋白氨基酸親水性比較Fig.2 Compaison of amino acid hydrophilicity of QHZK strain with VEDEVAC and C24V

圖3表明，通過對QHZK株E0蛋白B細胞表位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在位點60～65、72～78、118～122、128～133、215～220處的峰值較高，而在該區(qū)域內(nèi)E0蛋白氨基酸的親水性與抗原性峰值均較高，因此，這些位點可能為BVDV QHZK株的B細胞抗原表位。

圖3 BVDV QHZK株E0蛋白B細胞抗原表位預(yù)測Fig.3 Forecasting of B cell epitope of E0of BVDV QHZK strain

2.2 E0基因的原核表達

2.2.1 E0基因的 RT－PCR 擴增 將 RT－PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在700bp左右處有一特異性擴增條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符（圖4），表明從病料中成功擴增出了BVDV的E0基因。

圖4 E0基因RT－PCR擴增產(chǎn)物的鑒定Fig.4 Identification of RT－PCR product of E0gene

2.2.2 重組質(zhì)粒pET－32a－E0的鑒定 重組質(zhì)粒pET－32a－E0經(jīng)PCR以及EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切得到約700bp目的基因片段，與預(yù)期的結(jié)果一致（圖5），證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒pET－32a－E0的PCR和酶切鑒定Fig.5 PCR and enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET－32a－E0

2.2.3 E0基因表達產(chǎn)物的檢測結(jié)果及純化 重組質(zhì)粒pET－32a－E0轉(zhuǎn)化入Rosetta感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h，將不同時間段收集的誘導(dǎo)菌液變性處理后進行SDS－PAGE分析（圖6）。在約44ku分子質(zhì)量標記處，出現(xiàn)明顯的電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的蛋白獲得表達。表達的蛋白用His－Trap FF預(yù)裝柱（GE公司）進行親合層析純化（圖7）。

圖6 E0基因表達產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE of E0gene expression

圖7 E0基因表達產(chǎn)物純化的SDS－PAGE分析Fig.7 SDS－PAGE of purified products of E0gene expression

2.2.4 QHZK株E0基因表達產(chǎn)物的 Western blot鑒定 用BVDV標準陽性血清與E0基因表達產(chǎn)物進行Western blot試驗，結(jié)果顯示牛抗BVDV標準陽性血清與表達的融合蛋白呈陽性反應(yīng)，并且表達的蛋白與BVDV陰性血清不反應(yīng)（圖8），表明QHZK株BVDV E0基因獲得正確表達。

圖8 表達產(chǎn)物的Western blot檢測Fig.8 Western blot analysis of the expressed protein

3 討論

牦牛作為青藏高原上的稀有牛種，主要生長在我國2500m～5000m的高山草原上。自1983年，李佑民等[7]在我國首次分離并鑒定出BVDV以來，該病在我國牛群中流行較廣，造成了極大的危害，此外，BVDV還能感染豬，并且在臨床上不表現(xiàn)特征性的臨床癥狀，多為持續(xù)性感染，這也是導(dǎo)致BVD廣泛流行的原因之一，因此，建立特異、敏感、快速的診斷方法，研制有效的疫苗，預(yù)防和控制牛病毒性腹瀉病的發(fā)生意義重大[8]。目前，國內(nèi)學(xué)者對于牦牛BVDV分子生物學(xué)方面的報道較少，因此，開展牦牛BVDV的分子生物學(xué)研究意義重大。本研究對青海牦牛BVDV毒株的E0蛋白進行了生物信息學(xué)分析，采用生物學(xué)軟件對E0蛋白的抗原指數(shù)、親水性及B細胞抗原表位進行了分析。結(jié)果表明，E0蛋白氨基酸的親水性與抗原性指數(shù)呈平行相關(guān)性，QHZK株E0蛋白氨基酸的親水性與抗原性指數(shù)與標準毒株VEDEVAC、C24V非常相似，從而證明E0基因在BVDV各毒株間具有一定保守性，有利于亞單位疫苗研究。

本研究用原核表達載體表達BVDV E0基因時發(fā)現(xiàn)，E0基因所含的密碼子有10%左右是E.coli不常用的稀有密碼子。有資料表明，當目的基因中存在過多E.coli不常使用的密碼子時，其在E.coli中的表達量一般很低[9]，所以本研究在表達E0基因時采用了Rosetta（DE3）菌株，該菌株因可以提供密碼子tRNAs，從而可以顯著提高帶有較多稀有密碼子的E0基因在E.coli中的表達量，試驗結(jié)果也證明E0蛋白得到了較高的表達量。

E0是BVDV編碼蛋白中保守性較E2更高的蛋白，該蛋白上的中和表位產(chǎn)生的中和抗體具有中和BVDV和HCV的能力[10]，氨基酸序列分析結(jié)果也表明，在此蛋白內(nèi)有一高度保守的結(jié)構(gòu)域，因此E0蛋白更適合做亞單位基因工程疫苗，E0蛋白氨基酸生物信息學(xué)分析也證明了這一點。本研究中所表達的E0蛋白在Western blot試驗中能與標準毒株制備的抗BVDV陽性血清發(fā)生免疫反應(yīng)。

[1]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[2]Rumenapf T，Unger G，Strauss J H，et al.Processing of the envelope glycoproteins of peativiruses[J].J Virol，1993，67（6）：3288－3294.

[3]胡炳峰，劉亞剛，王文伯，等.牦牛病毒性腹瀉病病毒E2基因的克隆及序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：93－96.

[4]Hertig C，Stalder H，Peterhans E.Genetic heterogenecity within the coding region of E2and NS2in strain of bovine viraldiarrhea virus[J].Gene，1995，153（2）：191－195.

[5]項 勛，段 綱.牛病毒性腹瀉／粘膜病病毒（BVDV）的分子生物學(xué)研究進展[J].家畜生態(tài)，2004，25（4）：202－204.

[6]張芳芳，王光華，鄭福英，等，青海牦牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（11）：1101－1105.

[7]李佑民，劉振潤.牛病毒性腹瀉／粘膜病病毒株（長春184株）的分離與鑒定[J].獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1983，3（3）：113－120.

[8]楊小燕，魏春華，劉建奎，等.豬源牛病毒性腹瀉病毒的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（1）：9－13.

[9]Chen T，Inouye M.Suppression of the negative effect of minor argine codons on gene expression，preferential usage of minor codons with in the first 25codons of the Eschiscoli genes[J].Nucleic Acids Res，1990，18：1465－1473.

[10]于吉鋒，劉亞剛，楊小艷，等.牛病毒性腹瀉病毒牦牛株E0基因生物信息學(xué)分析及原核表達與抗原性檢測[J].西南民族大學(xué)學(xué)報，2009，35（3）：504－507.