臧瑩安，黃彩梅，李婉雁，李 淼，宋 帥，李春玲＊

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科學(xué)系，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東 廣州 510640）

副豬嗜血桿菌（HPS）一般條件下難以分離和培養(yǎng)，尤其是應(yīng)用抗生素治療過病豬的病料，因而給副豬嗜血桿菌病的診斷帶來困難。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有操作簡單、反應(yīng)速度快、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，很適合應(yīng)用于實踐。國內(nèi)外采用ELISA對HPS進行檢測研究的為數(shù)不少，但都以全菌研究為主，尚未見有針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5（OMP P5）的間接ELISA抗體檢測方法。且操作過程中加樣作用時間也不盡相同，其中以30、60、120min居多。對酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的選擇也各有差異，其中以30min和60min為反應(yīng)時間的較多[1－2]。造成檢測操作時間過長，結(jié)果不夠穩(wěn)定，差異較大。目前，尚未找到一種理想的ELISA抗體檢測方法。

外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）是副豬嗜血桿菌的主要毒力因子之一[3]，是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，占其全部組成的一半，在維持外膜結(jié)構(gòu)，保證物質(zhì)運輸，作為大腸菌素、噬菌體受體以及參與F因子結(jié)合等方面均有重要的作用。許多致病菌的OMP具有良好的免疫原性，可同時激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫，具有異種血清型的免疫交叉保護作用，是一種潛在的共同保護性抗原[4]。研究結(jié)果顯示，OMP P5蛋白具有豐富的二級結(jié)構(gòu)，其β2轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域可能形成抗原表位。OMP P5蛋白無跨膜區(qū)，提示該蛋白可能實現(xiàn)較高量及可溶性的表達。HPS OMP P5很有可能成為檢測或診斷副豬嗜血桿菌病的候選抗原，作為一種臨床上診斷HPS的新手段[5]。

本研究將重組表達純化的副豬嗜血桿菌P5蛋白（OMP P5）作為包被抗原，對已有間接ELISA抗體檢測方法的最佳封閉條件、最佳加樣作用時間、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間進行優(yōu)化探索。應(yīng)用優(yōu)化后的方法對進行和未進行HPS免疫的健康豬的血清樣品進行檢測，以考察該方法的可靠性，進一步對豬場送檢血清進行檢測以驗證該方法的應(yīng)用效果，為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)副豬嗜血桿菌檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及血清 抗原為HPS OMP P5基因表達并純化復(fù)性后蛋白，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)豬病研究室制備；HPS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、HPS標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、待測血清，采自本試驗飼養(yǎng)的未進行HPS免疫的健康豬；待檢血清，來自廣東地區(qū)豬場HPS免疫的健康豬。

1.1.2 主要試劑 四甲基聯(lián)苯胺（TMB），牛血清白蛋白（BSA），辣根過氧化物酶（HEP）標(biāo)記羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豬IgG等。

ELISA所用溶液：包被緩沖液（0.05mol／L碳酸鹽緩沖液pH9.6）；封閉液（牛血清白蛋白1g加入100mL的包被液中混勻，現(xiàn)配先用）；洗滌緩沖液（PH7.4PBST）；抗體稀釋液（0.5g BSA 溶解于100mL PBST中）；底物緩沖液（DMSO）；TMB底物顯色液；終止液（2mol／L H2SO4）。均用分析純試劑配制。

1.1.3 儀器和設(shè)備 PSX－280B手提式高壓滅菌鍋，購自上海申安醫(yī)療器械廠；單人雙面凈化工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；680酶標(biāo)儀，購自BIO RAD公司；FC－16C高速離心機，購自ZENTRIFUGEN；恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；96孔酶標(biāo)板，購自美國COSTAR公司。

1.2 方法

1.2.1 供試血清的制備 用一次性注射器從豬前腔靜脈或耳緣靜脈采集血液5mL／頭（不加抗凝劑），室溫靜置2h～6h后，5000r／min離心5min，取上清液置于EP管中。處理好的血清置于冰箱中3℃～4℃保存?zhèn)溆?。其中，所?nèi)飼養(yǎng)的已進行和未進行HPS免疫接種的健康豬各10頭，某豬場送檢血清90份。

1.2.2 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的建立

1.2.2.1 基本操作程序 用包被液以1∶500稀釋度稀釋抗原液，100μL／孔加入96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板，洗滌。封閉后加樣，100μL／孔加入用抗體稀釋液按1∶100稀釋的血清，洗滌后加入用1∶5000稀釋液稀釋的酶標(biāo)二抗，再加顯色液、終止液，最后測定各孔OD450nm值。

1.2.2.2 最佳加樣作用時間的確定 ELISA抗體檢測試驗加樣作用時間點分別設(shè)為15、30、45、60、75、90、105、120min，各點設(shè)3次重復(fù)。設(shè)各陰性檢測孔OD450nm為N，陽性檢測孔OD450nm為P，計算出P／N值平均值。結(jié)果判定[5]：選擇陽性血清OD450nm／陰性血清OD450nm比值（P／N）最大的時間點為最佳加樣作用時間。

1.2.2.3 最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定 ELISA抗體檢測試驗酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間點分別設(shè)為15、30、45、60min。具體操作與結(jié)果判定同1.2.2.2。

1.2.2.4 HPS OMP P5抗體檢測 用同一批制備的抗原包被酶標(biāo)板，取標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各3份，待檢血清10份進行ELLSA批內(nèi)重復(fù)試驗。測定其OD450nm值，計算P／N。

用不同時間包被的酶標(biāo)板，取標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各3份，待檢血清10份進行ELLSA批間重復(fù)試驗。測定其OD450nm值，計算P／N。

判定標(biāo)準(zhǔn)：如樣品P／N值＞（標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450nm－空白 OD450nm）／（標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450nm－空白OD450nm）＝3.29，則判斷為陽性，反之則判斷為陰性。

2 結(jié)果

2.1 最佳加樣反應(yīng)時間的確定

由表1可知，反應(yīng)時間在15、30、60min的P／N值較之于其他加樣時間的P／N值高且穩(wěn)定。并且，在15min時的P／N值顯著比其他時間的P／N值高（P＜0.01）。所以，最佳加樣反應(yīng)時間為15min。

2.2 最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定

為了排除加樣反應(yīng)時間對酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的影響，以較為適合的加樣反應(yīng)時間（分別為15、30、60min）進行檢測，酶標(biāo)二抗反應(yīng)測試時間點分別為15、30、45、60min。表2結(jié)果顯示，在15min時的P／N值顯著高于其他時間的P／N值（P＜0.01），最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間為15min。加樣反應(yīng)時間與酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間具有一定的相互獨立性。

2.3 送檢血清樣本檢測結(jié)果

2.3.1 已進行和未進行HPS免疫的健康豬群檢測結(jié)果 應(yīng)用已優(yōu)化最佳加樣作用時間和酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的間接ELISA檢測方法對已進行和未進行HPS免疫接種的健康豬群進行HPS OMP P5抗體檢測，結(jié)果顯示，未進行HPS免疫接種的檢測血樣中均為HPS抗體陰性，已進行HPS免疫接種的檢測血樣中為HPS抗體陽性的達到95%。

表1 最佳加樣反應(yīng)時間的確定Table1 The determination of the best sample reaction time

表2 酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的確定Table2 The determination of the best enzyme standard reaction time

2.3.2 對某豬場90份送檢血清檢測結(jié)果 應(yīng)用已建立的HPS間接ELISA抗體檢測方法對某豬場90份血清的OMP P5進行檢測，結(jié)果見表3。豬場送檢的血清中陽性血清檢出率高達80%，其中母豬的陽性率較低（30%），保育仔豬陽性率較高（90%），育肥豬和哺乳仔豬高達100%。

表3 90份送檢血清OMP P5ELISA抗體的檢測結(jié)果Table3 ELISA Ab test results of OMP P5of 90sera

3 討論

隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，副豬嗜血桿菌對我國各豬場危害日趨嚴重。急需一種有效、快速的診斷方法[6]。目前，檢測HPS的方法很多，間接ELISA方法是血清學(xué)檢測方法中較為敏感、特異的方法[7]。選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA檢測方法的關(guān)鍵。在目前的大多數(shù)研究中，還是以全菌研究為主，也許是由于半菌的毒力不足以達到相應(yīng)的毒力，進而影響到試驗結(jié)果[8－9]。某些細菌的不同血清型間有相同的OMP免疫原性，可以產(chǎn)生交叉保護作用，這不僅為開發(fā)OMP亞單位疫苗提供了理論基礎(chǔ)，而且為疾病的診斷提供了特異性抗原，今后必將成為細菌領(lǐng)域的研究重點之一[10]。研究結(jié)果顯示，OMP P5蛋白具有豐富的二級結(jié)構(gòu)，其β2轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域可能形成抗原表位。OMP P5蛋白無跨膜區(qū)，提示該蛋白可能實現(xiàn)較高量及可溶性的表達。HPS OMP P5很有可能成為檢測或診斷副豬嗜血桿菌病的候選抗原，作為一種臨床上診斷 HPS的新手段[5]。

國內(nèi)外采用ELISA方法對HPS進行檢測研究的為數(shù)不少，但從未見有針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5（OMP P5）的間接ELISA抗體檢測方法。文獻中采用的操作過程中加樣作用時間也不盡相同，其中以30、60、120min居多。對酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間的應(yīng)用也各有差異，其中以30min和60min為反應(yīng)時間的較多[1－2]。造成檢測時間長，結(jié)果不夠穩(wěn)定，差異較大。所以，到目前為止，尚未建立一種理想的ELISA抗體檢測方法。

本研究利用HPS OMP P5基因表達并純化復(fù)性后蛋白作為包被蛋白，通過對最佳加樣作用時間的確定和最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間等條件的探索優(yōu)化，建立針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5（OMP P5）的間接ELISA抗體檢測方法。為研究獨立加樣時間與酶標(biāo)二抗時間對結(jié)果的影響，在用不同時間進行酶標(biāo)二抗時仍對加樣時間分別在15min～120 min范圍內(nèi)進行檢測。反應(yīng)結(jié)果顯示，加樣作用時間為15min，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間為15min，P／N值最高。所以，最佳加樣作用時間和最佳酶標(biāo)二抗反應(yīng)時間均確定為15min。

用本研究建立的間接ELISA方法對研究所內(nèi)飼養(yǎng)的未進行HPS免疫的健康豬和進行了HPS免疫的豬進行檢測，前者檢測血樣中HPS均為陰性，后者檢測血樣中為HPS陽性高達95%，和實際免疫情況高度一致，檢測時間亦大大縮短。在此基礎(chǔ)上，進一步對某豬場的90份血清進行檢測，該豬場送檢的血清中陽性血清檢出率高達81%，其中母豬的陽性率約為30%，仔豬陽性率高達90%。說明該豬場血樣中仔豬HPS陽性率較高?？赡苁且驗槟肛i分娩時為新生仔豬提供了很強母源免疫，仔豬體內(nèi)的母源抗體通?？梢跃S持到8周齡～12周齡。而且各豬場對于新生的仔豬都會有計劃的進行易受感染菌的接種免疫。隨母源抗體水平下降，仔豬仍然受到母源抗體一定程度的保護，此時會出現(xiàn)亞臨床感染，仔豬自身的免疫應(yīng)答反應(yīng)將被激活，從而產(chǎn)生HPS抗體。有時哺乳仔豬群也會發(fā)病，尤其是免疫水平較低的青年母豬產(chǎn)下的仔豬。

本研究建立的間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強、反應(yīng)快速準(zhǔn)確等特點，為副豬嗜血桿菌病的診治提供了參考方法，也為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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