于飛飛，陳福旺，宋 娜，楊 鑫，曹宇航，張 娟，傅震洲，王安峰，任林柱

（吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

基因敲除是通過(guò)同源重組將外源基因整合入靶細(xì)胞基因組特定位置，以達(dá)到置換、修飾、改造靶基因，從而改變靶基因所控制的生物性狀的目的[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種基因敲除動(dòng)物相繼問(wèn)世。1987年Doetschman等建立了次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因定點(diǎn)敲除的小鼠模型[2]；1997年[3]英國(guó)科學(xué)家Willmut首次報(bào)道了克隆羊“多利”的誕生，開(kāi)創(chuàng)了以體細(xì)胞為核供體的克隆動(dòng)物先例，極大地推動(dòng)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展[4]；潘求真等[5]研究了山羊體細(xì)胞基因打靶克隆，為高表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備提供了良好的手段與方法。近年來(lái)將基因敲除技術(shù)與核移植技術(shù)結(jié)合起來(lái)，制備和培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取得了較大的進(jìn)步。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化和呼吸道疾病為特征的傳染病[6]。PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，基因組為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約15kb[7]。根據(jù)病原基因組和血清型特性主要分為美洲型（代表株為VR2332）和歐洲型（代表株為L(zhǎng)V），兩者的核苷酸序列同源性約為60%，現(xiàn)階段在我國(guó)流行的主要為美洲型毒株[8]。完全分化的原代豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophage，PAM）是 PRRSV感染的靶細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在PAM上存在PRRSV的3個(gè)受體，分別為硫酸乙酰肝素（heparin sulphate，HS）、唾液酸黏附素 （sialoadhesin，Sn）和CDl63（cluster of differentiation 163）分子[9－12]。

CD163又名M130，為具有豐富半胱氨酸的清道夫受體家族（scavenger receptor cysteine rich，SRCR）成員之一，是單鏈跨膜糖蛋白分子，也是一種巨噬細(xì)胞分化的抗原。研究發(fā)現(xiàn)，CD163具有單核細(xì)胞－巨噬細(xì)胞特異性，在全身各種含豐富巨噬細(xì)胞的器官（如脾、肝、骨髓和淋巴結(jié)等）上高表達(dá)[13－14]。該蛋白在非易感的細(xì)胞表達(dá)，能使細(xì)胞獲得感染PRRSV的能力，還能產(chǎn)生子代病毒，抗人CD163的抗體可以阻斷PRRSV的感染，表明CD163是該病毒的必需受體。

本研究首先擴(kuò)增CD163基因5＇－端片段做為同源重組左臂，基因3＇－端片段做為同源重組右臂，與正負(fù)向篩選基因連接，構(gòu)建含正負(fù)篩選標(biāo)記的CD163基因的打靶載體，為構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163基因缺失細(xì)胞系和進(jìn)一步明確CD163在PRRSV感染過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒 E.coli DH5α及含正、負(fù)篩選標(biāo)志基因的打靶載體PSSC－9載體由本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pGEM－T購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 工具酶及試劑盒 限制性內(nèi)切酶SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SfiⅠ購(gòu)自Fermentas Molecular Biology公司；T4連接酶、2×Taq plus PCR MasterMix、DNA Marker 2000、DNA Marker 15000、DNA MarkerⅢ、細(xì)胞組織基因組提取試劑盒購(gòu)購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自博日科技（Bioflux）生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心。

1.2 方法

1.2.1 同源臂擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)Gen－Bank上的豬CD163基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物 PCDE2－3F和 PCDE3－4R，擴(kuò)增同源左臂（Sarm，約1.1kb），引物 PCDE5－6F 和PCDE5－6R擴(kuò)增同源右臂（Larm，約4.5kb）。

1.2.2 同源臂的擴(kuò)增及克隆 采用北京天根生化技術(shù)有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit從豬新鮮組織中提取豬基因組DNA，以上述引物分別擴(kuò)增同源左、右臂。

左臂擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板DNA為3μL，Primer 1（10μmol／L）與Primer 2（10μmol／L）均為2μL，2×Mster Mix為25μL，其余用ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2 min，后延伸72℃10min，30個(gè)循環(huán)。

右臂擴(kuò)增體系為：模板 DNA、Primer 3（10 μmol／L）與 Primer4（10μmol／L）均為1μL，2×Master Mix為12.5μL，其余用ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件94℃5min，94℃30s，55℃30，72℃5min；后延伸72℃10min，30個(gè)循環(huán)。

將上述同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收，連接在pGEM－T載體上。

1.2.3 T－Sarm與T－Larm重組質(zhì)粒鑒定 對(duì)重組的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，其中左臂用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，右臂用SalⅠ單酶切。此外，對(duì)連接在pGEM－T載體上的同源左右臂進(jìn)行測(cè)序分析，以檢驗(yàn)其正確性。

1.2.4 打靶載體的構(gòu)建 將鑒定正確的左、右臂片段酶切回收，亞克隆到pSSC－9載體上構(gòu)建成CD163基因敲除打靶載體。其中左臂用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，右臂用SalⅠ單酶切。用PCR方法和測(cè)序分析對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 同源臂的擴(kuò)增

提取豬基因組DNA，用PCR法成功擴(kuò)增了CD163基因打靶的同源左右臂，電泳及測(cè)序結(jié)果證明右臂大小約為4.5kb，左臂約為1.1kb（圖1）。

2.2 同源臂克隆及鑒定

將上述擴(kuò)增的CD163基因打靶的同源左右臂，與載體pGEM－T連接，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定，證明成功地將CD163基因打靶的同源左右臂克隆到了pGEM－T載體上（圖2，圖3）。

圖1 同源臂PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of homologous arms

圖2 T－Sarm的酶切鑒定Fig.2 Identification of T－Sarm with enzyme digesition

圖3 T－Larm的酶切鑒定Fig.3 Identification of T－Larm withenzyme digesition

2.3 CD163基因敲除打靶載體的構(gòu)建及鑒定

將上述成功克隆的CD163基因打靶的同源左右臂用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收相應(yīng)的DNA片段，并與pSSC－9連接，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序分析，證明成功的構(gòu)建了CD163基因敲除打靶載體pSSC－Larm－Sarm（圖4，圖5）。

3 討論

圖4 左臂鑒定圖Fig.4 Identification of the left homologous arm

圖5 右臂鑒定圖Fig.5 Identification of the right homologous arm

同源重組被廣泛用于基因敲除策略中，同源DNA序列發(fā)生遺傳交換致使外源基因整合到靶細(xì)胞基因組中并將目的基因替換以達(dá)到基因敲除的目的，所以，試驗(yàn)要求同源左右臂要具有高度的同源性[15]。本試驗(yàn)提取豬基因組DNA，用PCR法成功擴(kuò)增了CD163基因打靶的同源左右臂，成功獲得了同源右臂（4.5kb）和左臂（1.1kb），并經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其同源性高，擴(kuò)增效果好，同源左右臂中堿基錯(cuò)配機(jī)率小。此外，同源序列越長(zhǎng)我們擴(kuò)增的難度就越大，同時(shí)也影響膠回收的效果，而同源序列較短時(shí)，重組的概率減小[16]，以至于影響陽(yáng)性細(xì)胞的克隆，本試驗(yàn)中，右臂約4.5kb，左臂約為1.1kb，同源臂長(zhǎng)度設(shè)計(jì)合理，擴(kuò)增效果良好。

Chauhan S S等[17]構(gòu)建了pSSC－9通用型載體，該載體上存在Neo和HSV－tk雙標(biāo)記基因，它們與同源左右臂相連，同源重組發(fā)生時(shí)，同源部分發(fā)生雙交換，負(fù)篩選基因?qū)⒈蝗コ?，正篩選基因整合到靶細(xì)胞基因組中，以配合G418、GANC雙篩選，這個(gè)過(guò)程中載體與靶細(xì)胞基因組發(fā)生雙交換，只有正確重組的基因組在正負(fù)篩選系統(tǒng)中得以保留[18]。其打靶效率高，陽(yáng)性細(xì)胞易于篩選和鑒別，陽(yáng)性克隆明顯，整個(gè)操作過(guò)程可行性高，是目前最常用的敲除載體，也是我們的選擇該載體的原因。

Calvert J G 等[13]發(fā) 現(xiàn) CD163是 PRRSV 感 染Marc－145細(xì)胞所必須的受體。Van Gorp H 等[19]在Marc－145細(xì)胞檢測(cè)到CD163，并將細(xì)胞內(nèi)的CD163定位至早期內(nèi)吞體。在非易感細(xì)胞系CHO－K1、BHK－21和PK－15中瞬時(shí)表達(dá)CD163基因后，病毒可以復(fù)制并產(chǎn)生子代病毒，但是病毒感染的效率比較低[13，19]。

本試驗(yàn)以豬基因組為模板，擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163基因同源左臂和同源右臂，將擴(kuò)增片段與pGEM－T載體連接后進(jìn)行部分序列測(cè)定，并與已知相應(yīng)片段進(jìn)行同源性分析；再將擴(kuò)增的同源左右臂分別酶切后定向連接至pSSC－9載體中，構(gòu)建含Neo和Tk基因的雙標(biāo)記打靶載體pSSCLarm－Sarm，為構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征病毒受體CD163基因缺失細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，我們已經(jīng)將線性化的打靶載體用脂質(zhì)體法導(dǎo)入豬的胎兒成纖維細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞的篩選和鑒定工作正在進(jìn)行之中。

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