莫?jiǎng)偬m，施開(kāi)創(chuàng)，胡 杰，鄒聯(lián)斌，陸文俊，李 軍

（廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproduc-tive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可以引起以母豬繁殖障礙和各種年齡豬（特別是仔豬）嚴(yán)重的呼吸道疾病為主要特征的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）。PRRSV可以分為兩種基因型，即以VR－2332株為代表的美洲型毒株和以Lelystad virus（LV）為代表的歐洲型毒株，兩者之間的全基因組核苷酸序列同源性僅為60%左右。我國(guó)于1996年首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株[1]，2006年分離到以Nsp2蛋白發(fā)生第481位氨基酸和第533～561位氨基酸30個(gè)氨基酸缺失為標(biāo)志的高致病性美洲型變異毒株（HP－PRRSV）[2]，2010年分離到致病性PRRSV歐洲型毒株[3]。豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）可以引起各種年齡豬以高熱稽留、全身廣泛性出血以及母豬繁殖障礙為主要特征的豬瘟（CSF）。CSFV屬于單股正鏈RNA病毒，基因組大約12.3kb，含有一個(gè)大的編碼3898氨基酸的閱讀框（ORF）。CSF和PRRS均為我國(guó)一類動(dòng)物疫病，在我國(guó)各地時(shí)有發(fā)生，并且存在病原隱性感染和持續(xù)性感染的現(xiàn)象[4－5]。同時(shí) CSFV 和PRRSV混合感染和繼發(fā)感染嚴(yán)重[6]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前，已建立了檢測(cè)CSFV[7－8]、PRRSV[9－10]的單一RT－PCR方法，也建立了檢測(cè)CSFV 和PRRSV的多重 RT－PCR方法[11－12]，但迄今未見(jiàn)報(bào)道能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分CSFV以及PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株和歐洲型毒株的RT－PCR方法。本研究針對(duì)CSFV、PRRSV的基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，建立了能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分CSFV以及PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株和歐洲型毒株的多重RT－PCR方法，為CSFV和PRRSV的快速檢測(cè)以及流行病學(xué)研究提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及重組質(zhì)粒 PRRSV美洲型經(jīng)典毒株（VR－2332株）、美洲型變異毒株（疫苗毒JXA1－R株）、豬瘟病毒（CSFV，疫苗毒C株）、豬偽狂犬病病毒（PRV，疫苗毒 Bartha－K61 株）、豬細(xì)小病毒（PPV，疫苗毒N株）、豬口蹄疫病毒（FMDV，疫苗毒 OS／99株）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2，疫苗毒 LG株）由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存。含有PRRSV美洲型毒株ORF5基因的重組質(zhì)粒p－AM－ORF5、分別含有歐洲型毒株Nsp2基因片段、ORF567基因片段的重組質(zhì)粒p－EU－ORF1a、p－EUORF567由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒、pMD18－T 載體、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細(xì)胞為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank上登錄的CSFV石門株（AF092448）、PRRSV美洲型經(jīng)典毒株VR－2332株（AY150564）、高致病性變異毒株JXA1株（EF112445）以及歐洲型毒株LV株（M96262）的基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物（表1）。其中，CSF－NS2引物對(duì)擴(kuò)增CSFV NS2基因片段的大小為508bp；AM－Nsp2引物對(duì)擴(kuò)增PRRSV美洲型毒株Nsp2基因片段的大小在經(jīng)典毒株為338bp、在變異毒株為248bp；EU－ORF5引物對(duì)擴(kuò)增PRRSV歐洲型毒株ORF5基因片段的大小為614bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 病毒重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 分別取CSFV C株和 PRRSV VR－2332株、JXA1－R 株細(xì)胞培養(yǎng)液，用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA后，應(yīng)用PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以病毒cDNA或重組質(zhì)粒p－EU－ORF567為模板，分別應(yīng)用3對(duì)特異性引物，建立50μL PCR反應(yīng)體系：5×buffer 10μL，滅菌蒸餾水33.75μL，Ex Taq HS聚合酶（5 U／μL）0.25μL，上、下游引物（25pmol／μL）各0.5 μL，cDNA 5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min；94℃30s，56℃～58℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃10min?；厥誔CR產(chǎn)物、連接pMD18－T載體、轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞、培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定。本研究共構(gòu)建4種重組質(zhì)粒，其中由引物CSF－NS2擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為p－CSF－NS2，引物 AM－Nsp2擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別命名為 p－Nsp2－VR2332、p－Nsp2－JXA1，引物EU－ORF5擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為p－EU－ORF5。

表1 多重RT－PCR特異性引物Table1 The specific primers used for the multiplex RT－PCR

1.2.3 多重PCR退火溫度的確定 建立50μL PCR反應(yīng)體系：5× RT buffer 10μL，Ex Taq HS聚合酶（5U／μL）0.25μL，3對(duì)特異性引物的上、下游引物（25pmol／μL）各0.5μL，等比例混合的4種重組質(zhì)粒5μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL。在55.1℃～60℃間設(shè)定6個(gè)退火溫度進(jìn)行梯度PCR，確定最佳退火溫度。

1.2.4 多重PCR引物濃度的確定 50μL PCR反應(yīng)體系中，3對(duì)引物終濃度分別為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5pmol／μL，進(jìn)行不同濃度的排列組合，進(jìn)行PCR，確定最佳引物濃度。

1.2.5 多重PCR聚合酶濃度的確定 50μL PCR反應(yīng)體系中，Ex Taq HS聚合酶（5U／μL）終濃度分別為0.015、0.02、0.025、0.03、0.035U／μL，進(jìn)行PCR，確定最佳聚合酶濃度。

1.2.6 多重PCR循環(huán)數(shù)的確定 建立50μL PCR反應(yīng)體系，分別設(shè)置30、35、40、45個(gè)循環(huán)，進(jìn)行PCR，確定最佳循環(huán)數(shù)。

1.2.7 多重PCR的特異性試驗(yàn) 以重組質(zhì)粒p－CSF－NS2、p－Nsp2－VR2332、p－Nsp2－JXA1、p－EUORF5，以及FMDV的cDNA和PCV－2、PRV、PPV的DNA作為模板，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR，分析其特異性。

1.2.8 多重PCR的敏感性試驗(yàn) 將4種重組質(zhì)粒10倍系列稀釋成1.67×1010拷貝／μL～1.67×101拷貝／μL（50μL反應(yīng)體系終濃度為1.67×109拷貝／μL～1.67×100拷貝／μL）共10個(gè)濃度梯度。將同一濃度梯度的各種質(zhì)粒等體積混合后作為模板，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR，分析其敏感性。

1.2.9 多重PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 以等體積混合的4種重組質(zhì)粒為模板，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR，重復(fù)5次反應(yīng)，分析其重復(fù)性。

1.2.10 多重PCR的臨床應(yīng)用 臨床病料來(lái)自2010年－2011年廣西各地發(fā)病死亡的疑似病豬，共106份。取脾、肺、淋巴結(jié)各約5g，混合研磨后按1∶4（W／V）加入 PBS（pH7.2），反復(fù)凍融3次，10000r／min離心10min，取上清提取總RNA。應(yīng)用所建立的多重 RT－PCR方法，進(jìn)行CSFV和PRRSV檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

分別以CSFV C株和PRRSV VR－2332株、JXA1－R株的cDNA以及歐洲型毒株重組質(zhì)粒p－EU－ORF567為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增相應(yīng)的目的片段，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p－CSF－NS2、p－Nsp2－VR2332、p－Nsp2－JXA1 和 p－EU－ORF5（圖1）。

2.2 最佳退火溫度的確定

設(shè)定6個(gè)退火溫度進(jìn)行梯度PCR，各個(gè)退火溫度均能擴(kuò)增出條帶（圖2）。在57.3℃條帶最清晰，且不存在非特異性條帶，確定為最佳退火溫度。

2.3 最佳引物濃度的確定

建立50μL反應(yīng)體系，固定其它條件不變，以3對(duì)引物CSF－NS2、AM－Nsp2及EU－ORF5不同濃度的排列組合進(jìn)行多重PCR。最終確定各對(duì)引物的最佳濃度（反應(yīng)終濃度）：CSF－NS2為0.5pmol／μL、AMNsp2為1.25pmol／μL、EU－ORF5為0.5pmol／μL（圖3）。

圖1 重組質(zhì)粒鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmids

2.4 最佳聚合酶濃度的確定

建立50μL反應(yīng)體系，固定其它條件不變，Taq HS聚合酶分別以0.0125、0.02、0.025、0.03、0.035 U／μL濃度進(jìn)行多重PCR，最終確定最佳聚合酶濃度為0.03U／μL（圖4）。

2.5 最佳循環(huán)數(shù)的確定

建立50μL反應(yīng)體系，固定其它條件不變，分別設(shè)置30、35、40、45個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR，最終確定最佳循環(huán)數(shù)為40個(gè)（圖5）。

圖2 退火溫度的選擇Fig.2 Selection of the annealing temperature for the multiplex RT－PCR

圖3 引物濃度的選擇Fig.3 Selection of the primer concentration for the multiplex RT－PCR

2.6 最佳反應(yīng)條件的確定

經(jīng)優(yōu)化，多重RT－PCR包括反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩步程序。10μL反轉(zhuǎn)錄體系為：無(wú)RNA酶滅菌雙蒸水 0.75μL，10× RT buffer[100mmol／L Tris－HCl（pH8.3），500mmol／L KCl]1.0μL，MgCl2（25mmol／L）2.0μL，dNTP（各10mmol／L）1.0μL，隨機(jī)引物9聚體（50pmol／μL）0.5μL，RNA酶抑制劑（40U／μL）0.25μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U／μL）0.5μL，模板總RNA 4.0μL；反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?0℃10min，42℃30min，99℃5min。50μL PCR反應(yīng)體系為：5×RT buffer 10μL，Ex Taq HS聚合酶（5U／μL）0.3 μL，引物CSF－NS2（25 pmol／μL）各1μL、引物 AM－Nsp2（25pmol／μL）各2.5μL、引物 EU－ORF5（25pmol／μL）各1μL，cDNA 5μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min；94℃30s，57.3℃30s，72℃45s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。

圖4 聚合酶濃度的選擇Fig.4 Selection of the Taq polymerase concentration for the multiplex RT－PCR

圖5 循環(huán)數(shù)的選擇Fig.5 Selection of the reaction cycles for the multiplex RT－PCR

2.7 特異性分析

以4種重組質(zhì)粒的不同排列組合，以及FMDV的cDNA和PCV－2、PRV、PPV的DNA作為模板，進(jìn)行多重PCR。結(jié)果只有4種重組質(zhì)粒的不同排列組合反應(yīng)呈陽(yáng)性，而 FMDV、PCV－2、PRV、PPV均為陰性，沒(méi)有交叉反應(yīng)（圖6）。

2.8 敏感性分析

分別以10倍系列稀釋的4種重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行單重 PCR。結(jié)果，引物 CSF－NS2以 p－CSFNS2為模板的檢出下限為1.67×103拷貝／μL，引物AM－Nsp2以質(zhì)粒p－Nsp2－VR2332 或 p－Nsp2－JXA1為模板的檢出下限均為1.67×102拷貝／μL，引物EU－ORF5以質(zhì)粒p－EU－ORF5為模板的檢出下限為1.67×103拷貝／μL（圖7）。而將10倍系列稀釋的4種重組質(zhì)粒等體積混合后作為模板進(jìn)行多重PCR，結(jié)果3對(duì)引物的檢出下限均為1.67×103拷貝／μL（圖8）。

圖6 多重PCR的特異性試驗(yàn)Fig.6 The specificity test of the multiplex RT－PCR

圖7 PCR的敏感性試驗(yàn)Fig.7 The sensitivity test of the single RT－PCR

2.9 重復(fù)性分析

以含有1.67×108拷貝／μL重組質(zhì)?；旌衔餅槟０?，在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR。結(jié)果顯示，5次重復(fù)試驗(yàn)均能擴(kuò)增出均勻一致的目的片段（圖9），具有很好的重復(fù)性。

2.10 臨床病料檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用所建立的多重RT－PCR方法對(duì)106份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果CSFV和PRRSV變異株混合感染陽(yáng)性病科4份，占3.77%（4／106）；CSFV陽(yáng)性7份，占6.60%（7／106）；PRRSV變異株陽(yáng)性17份，占16.04%（17／106）。隨機(jī)選取上述陽(yáng)性樣品各4份，回收PCR產(chǎn)物、克隆、測(cè)序，證實(shí)為CSFV或PRRSV。部分臨床病料檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖8 多重PCR的敏感性試驗(yàn)Fig.8 The sensitivity test of the multiplex RT－PCR

圖9 多重PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.9 The repeatability test of the multiplex RT－PCR

圖10 部分臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Fig.10 The detection results of the clinical samples by the multiplex RT－PCR

3 討論

當(dāng)前，PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株（HPPRRSV）以及歐洲型毒株在我國(guó)均有流行，HPPRRSV仍然是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行毒株，而新近證實(shí)在我國(guó)存在的歐洲型毒株間也具有明顯的基因組差異[13]，因此PRRSV流行毒株在臨床上日益復(fù)雜。豬瘟是我國(guó)豬群的老疫病，經(jīng)過(guò)多年采取強(qiáng)制免疫、撲殺及綜合防控措施，該病得到有效控制。當(dāng)前，全世界的CSFV流行毒株可以分為3個(gè)基因群，在我國(guó)流行的毒株為基因1群和2群，其中基因1群與我國(guó)1945年分離的石門強(qiáng)毒有很近的遺傳關(guān)系，在我國(guó)豬瘟流行中占次要地位；基因2群與歐洲流行的基因2群病毒有較近遺傳關(guān)系，在我國(guó)豬瘟流行中占主導(dǎo)地位[14]。HP－PRRSV和CSFV已成為近年來(lái)嚴(yán)重危害我國(guó)豬群健康的兩種重要病原，而且PRRSV和CSFV繼發(fā)感染、混合感染屢見(jiàn)不鮮[6]，由此給養(yǎng)豬業(yè)造成的損失日益嚴(yán)重。因此，建立能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分CSFV以及PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、HP－PRRSV、歐洲型毒株的病原學(xué)診斷方法，對(duì)快速鑒別診斷CSF和PRRS，以便果斷、有效處置疫情意義重大。

本研究根據(jù)CSFV基因組序列在NS2基因比較保守[15]，以及PRRSV 基因組序列在 Nsp2及ORF5基因變異較大的特點(diǎn)[13，16]，利用位于 CSFV NS2基因區(qū)域的一對(duì)引物擴(kuò)增CSFV，利用位于PRRSV Nsp2基因高變區(qū)的一對(duì)引物特異擴(kuò)增并區(qū)分美洲型經(jīng)典毒株與變異毒株，利用位于ORF5基因高變區(qū)的一對(duì)引物特異擴(kuò)增歐洲型毒株，實(shí)現(xiàn)了利用3對(duì)特異引物在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中，鑒別4種不同毒株即CSFV以及PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、HP－PRRSV、歐洲型毒株。通過(guò)對(duì)影響多重RT－PCR反應(yīng)的主要因素的優(yōu)化，確定了引物退火溫度、引物濃度、聚合酶濃度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)，獲得了多重PCR的最佳反應(yīng)條件，成功建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的PRRSV多重RT－PCR檢測(cè)方法。并且，應(yīng)用該法檢測(cè)了106份臨床病料，進(jìn)一步證實(shí)了其可靠性。

本研究應(yīng)用所建立的多重RT－PCR方法檢測(cè)2010年－2011年采自廣西各地的疑似病料，發(fā)現(xiàn)CSFV、PRRSV存在單獨(dú)感染和混合感染現(xiàn)象。在檢測(cè)的106份病料中，CSFV的陽(yáng)性率為10.38%（11／106），表明由CSFV給豬群帶來(lái)的危害依然嚴(yán)重；PRRSV 的陽(yáng)性率為19.81%（21／106），均為HP－PRRSV，說(shuō)明PRRSV變異毒株已成為廣西流行的優(yōu)勢(shì)毒株；雖然未檢測(cè)到歐洲型毒株陽(yáng)性病料，但最近國(guó)內(nèi)已分離到致病性歐洲型毒株[3]，廣西豬群依然面臨來(lái)自歐洲型毒株的潛在威脅。值得注意的是，CSFV 和PRRSV混合感染占3.77%（4／106），其危害性不容忽視。由于PRRSV感染可以抑制動(dòng)物機(jī)體對(duì)豬瘟疫苗的免疫反應(yīng)，延緩和降低細(xì)胞免疫和體液免疫強(qiáng)度[17]，導(dǎo)致PRRSV感染豬群即使進(jìn)行了豬瘟弱毒疫苗的免疫預(yù)防接種，但免疫效果不佳，豬群得不到有效的免疫保護(hù)，仍然存在豬瘟野毒感染和發(fā)病的危險(xiǎn)，這可能是近年來(lái)一些豬群免疫接種豬瘟疫苗后依然散發(fā)豬瘟的原因之一。當(dāng)前，抓好CSFV和PRRSV的病原學(xué)監(jiān)測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查，是有效應(yīng)對(duì)日益復(fù)雜的CSF和PRRS疫情的重要基礎(chǔ)。

本研究針對(duì)CSFV和PRRSV基因組序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立了能夠同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分CSFV以及PRRSV美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株和歐洲型毒株的多重RTPCR方法，為CSFV和PRRSV的快速鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。

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