王 赟，龍高群，張春林＊，田 茂

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004）

溶菌酶（EC3.2.1.17），又稱 N－乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，它能切斷肽聚糖中的N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸之間的β－1，4糖苷鍵之間的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓的作用下使細(xì)胞脹裂開，引起細(xì)菌裂解[1]。因此，它是一種廣譜的抗菌效應(yīng)分子。除此之外，它還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成和分泌[2－3]。

在動物中有3種不同類型的溶菌酶，即c型溶菌酶（chicken－lysozyme type）、g 型溶菌酶（goosetype）和i型溶菌酶（invertebrate－type）[4－5]。其中，c型溶菌酶是同時存在于無脊椎動物和脊椎動物中的類型，g型溶菌酶主要存在于脊椎動物，而i型溶菌酶存在于無脊椎動物中。近年來對i型溶菌酶的研究多見于海洋生物，如文蛤[6]、斑節(jié)對蝦[7]等，但對昆蟲i型溶菌酶的研究較為少見。昆蟲具有許多免疫功能的多肽類物質(zhì)，與血細(xì)胞一起組成了昆蟲體內(nèi)免疫功能體系。受到細(xì)菌等異物刺激后，很多昆蟲均能有效誘導(dǎo)溶菌酶、抗菌肽、凝集素和血素等血淋巴抗菌蛋白的增加，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫防衛(wèi)機(jī)能，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8]。

美洲大蠊屬于昆蟲綱蜚蠊目，是南方地區(qū)室內(nèi)優(yōu)勢品種，它能攜帶許多病原微生物如痢疾桿菌、副傷寒沙門菌、綠膿桿菌和寄生蟲等，是家畜及人類許多傳染性疾病的重要傳播媒介。因而它可能具有獨特的免疫防御機(jī)制，比一般生物更能有效抵御病原微生物的感染。有研究報道，發(fā)現(xiàn)美洲大蠊在大腸埃希菌誘導(dǎo)后，其血淋巴的抗菌活性增強(qiáng)，考慮經(jīng)誘導(dǎo)后其溶菌酶、抗菌肽、凝集素和血素等血淋巴的抗菌蛋白增加[9]。本研究通過RT－PCR技術(shù)和RACE PCR技術(shù)獲得了美洲大蠊i型溶菌酶全長編碼區(qū)，并預(yù)測了其可能具有的功能，為今后對該基因功能及分子進(jìn)化的研究提供了重要的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為美洲大蠊（Periplaneta americana），由貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室飼養(yǎng)繁殖。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊i型溶菌酶基因片段的獲取 以岡比亞按蚊i型溶菌酶氨基酸序列（XP－309527）為探針，對美洲大蠊EST序列庫進(jìn)行tBLASTn檢索，僅得到1條與之同源的序列。將此序列用ORF Finder查找開放閱讀框，并進(jìn)行BLAST比對，為潛在i型溶菌酶編碼基因，但其編碼區(qū)5'端不完整。

1.2.2 利用RT－PCR獲得美洲大蠊i型溶菌酶基因片段 采用Trizol法提取新鮮美洲大蠊組織樣本總RNA，用紫外分光計測定總RNA純度和濃度，cDNA第一鏈的合成按照Fermentas第一鏈合成試劑盒操作說明進(jìn)行。根據(jù)比對獲得的美洲大蠊?jié)撛趇型溶菌酶基因片段設(shè)計引物，上游引物5'－CAAAGTCTCTGGTTCTGGTG－3'，下游引物5'－ACACTAGACAGCAGAGGAG－3'，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25μL：10×buffer緩沖液 2.5μL，MgCl2（25 mmol／L）2.5μL，dNTPs Mixture（10nmol／L）2.0 μL，mtP1引物（10mmol／L）2.0μL，mtP2引物（10 mmol／L）2.0μL，模板 DNA（50ng／μL）2.0μL，Taq酶（5U／μL）0.2μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，并與pMD－18T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α；藍(lán)白斑篩選陽性克隆并經(jīng)菌落PCR驗證后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，從而得到美洲大蠊i型溶菌酶部分cDNA序列。

1.2.3 利用5'－RACE PCR擴(kuò)增已知cDNA片段5'末端 根據(jù)測序獲得的cDNA部分序列，設(shè)計5'－RACE PCR引物L(fēng)ysozyme 5'GSP：5'－GCAGCCTGCACTTGTCGCTGACATT－3'和 Lysozyme 5'Nest：5'－AGCCACCTAGGCGATGGATGGCTGCAT－3'。本試驗根據(jù)GeneRacerTM Kit試劑盒說明，擴(kuò)增出已知cDNA片段的5'末端并進(jìn)行測序。

1.2.4 用生物信息學(xué)方法對美洲大蠊i型溶菌酶基因序列進(jìn)行分析 將RT－PCR和5'－RACE PCR測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，并用ORF Finder預(yù)測美洲大蠊i型溶菌酶的開放閱讀框，推導(dǎo)出氨基酸序列。用NCBI Blast對該序列進(jìn)行同源比對。用ProtParam分析該蛋白等電點、分子質(zhì)量和分子式；ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性；Singal P進(jìn)行信號肽預(yù)測；TMHMM對跨膜區(qū)進(jìn)行分析；ExPASY的TargetP對該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；DNA Star軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；SWISSMODEL進(jìn)行同源建模[10]。利用Clustal W對美洲大蠊和其他物種的i型溶菌酶進(jìn)行同源比對，并用Mega軟件構(gòu)建c型溶菌酶、i型溶菌酶和g型溶菌酶的分子系統(tǒng)樹，預(yù)測進(jìn)化關(guān)系。

圖1 美洲大蠊i型溶菌酶RT－PCR結(jié)果Fig.1 RT－PCR result of i－type lysozyme from Periplaneta americana

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊i型溶菌酶基因的獲得

以岡比亞按蚊i型溶菌酶為探針，比對獲得美洲大蠊?jié)撛诰幋ai型溶菌酶的EST序列，針對此序列設(shè)計引物經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增，獲得511bp的片段（圖1）。將此序列在NCBI進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其僅具備i型溶菌酶部分保守結(jié)構(gòu)域，編碼區(qū)具備終止密碼子，無起始密碼子。因此，針對此序列設(shè)計5'－RACE引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得445bp的片段（圖2）。將兩端序列進(jìn)行拼接，得到了總長為525bp的溶菌酶基因片段。將此序列登錄GenBank，登錄號為JQ754173。

2.2 美洲大蠊i型溶菌酶的生物信息學(xué)分析

2.2.1 美洲大蠊i型溶菌酶序列特征 在獲得的美洲大蠊i型溶菌酶525bp片段中，包括5'非編碼區(qū)12bp和3'非編碼區(qū)18bp。其完整的開放閱讀框長495bp，編碼164個氨基酸（圖3）。經(jīng)ProtParam分析，該蛋白的等電點為5.69，分子質(zhì)量計算值為17.6ku，分子式為C769H1192N210O234S16。

2.2.2 美洲大蠊i型溶菌酶信號肽預(yù)測 將推導(dǎo)的美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列在丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（CBS）的網(wǎng)站ht tp：／／www.cbs.dt u.dk／services／SignalP／上進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示，其N端具有27個氨基酸的信號肽MATACKSLVLVAAAAIACSLFGSFTLG，從而可以判定其為胞外表達(dá)的效應(yīng)分子，成熟肽包含136個氨基酸（圖4）。

圖2 美洲大蠊i型溶菌酶5'－RACE PCR結(jié)果Fig.25 '－RACE PCR result of i－type lysozyme from Periplaneta americana

圖3 美洲大蠊i型溶菌酶核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

圖4 美洲大蠊i型溶菌酶信號肽分析結(jié)果Fig.4 The prediction of signal peptide of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

2.2.3 美洲大蠊i型溶菌酶親水性與疏水性分析通過 ProtScal（http：／／web.expasy.org／cgi－bin／protscale／protscale）分析該蛋白的親水性和疏水性，結(jié)果顯示該蛋白在1～20氨基酸處有一明顯的疏水性區(qū)域（圖5），其中第16位的異亮氨酸疏水性最強(qiáng)（分值為4.500），而第92位精氨酸親水性最強(qiáng)（分值為－4.500）。

2.2.4 美洲大蠊i型溶菌酶跨膜區(qū)分析 TMHMM （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）預(yù)測美洲大蠊i型溶菌酶在第7～26位氨基酸區(qū)域有一明顯的跨膜區(qū)（圖6）。

2.2.5 美洲大蠊i型溶菌酶的亞細(xì)胞定位 通過在線軟件PSORT（http：／／psort.hgc.jp／form2.html）分析美洲大蠊i型溶菌酶的亞細(xì)胞定位，預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白主要分泌到細(xì)胞外（55.6%），其余存在于細(xì)胞質(zhì)、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中（各占11.1%）。

2.3 美洲大蠊i型溶菌酶結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 美洲大蠊i型溶菌酶二級結(jié)構(gòu)分析 利用DNA Star軟件對美洲大蠊i型溶菌酶的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖7），結(jié)果顯示按Chou－Fosman預(yù)測法，該蛋白α－螺旋、β－折疊和β－轉(zhuǎn)角較均勻地分布于整個氨基酸鏈。

2.3.2 美洲大蠊i型溶菌酶三級結(jié)構(gòu)的分析 將美洲大蠊i型溶菌酶的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫搜索（Conserved Domain Database，CDD），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它具有失穩(wěn)酶家族（Destabilase superfamily）的保守結(jié)構(gòu)域。利用SWISS－MODEL同源建模，得到美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列的預(yù)測三級結(jié)構(gòu)，與已知的i型溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)模型相似性很高。

圖5 美洲大蠊i型溶菌酶疏水性分析結(jié)果Fig.5 Hydrophobicity analysis of i－type lysozyme from Periplaneta americana

圖6 美洲大蠊i型溶菌酶跨膜區(qū)分析結(jié)果Fig.6 Transmembrane domain analysis of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

2.4 美洲大蠊i型溶菌酶同源性比較和分子進(jìn)化分析

美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列經(jīng)Blast分析顯示，它與黑腹果蠅、岡比亞按蚊i型溶菌酶有較高的相似性（分別為64%和53%）（圖8）。將該序列與線形動物門的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，登錄號NP－500207），環(huán)節(jié)動物門的醫(yī)蛭（Hirudo medicinalis，登錄號 AAA96144）和安德愛勝蚓（Eisenia andrei，登錄號 ABC68610），軟體動物門的菲律賓蛤仔（Venerupis philippinarum，登錄號BAB33389）、美洲牡蠣（Crassostrea virginica，登錄號P83673），節(jié)肢動物門的岡比亞按蚊（A－nopheles gambiae，登錄號AAT51799、ABP35929）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster，登錄號ACD99447）、意大利蜜蜂（Apis mellifera，登錄號XP＿393161）、地熊蜂（Bombus terrestris，登錄號 XP＿003394100）和棘皮動物門的刺參（Apostichopus japonicus，登錄號ABK34500）、紅海盤車（Asterias rubens，登錄號AAR29291）的i型溶菌酶成熟肽進(jìn)行Clustal W比對（圖8），可以看出所有物種的i型溶菌酶均具有異構(gòu)肽活性位點H。除節(jié)肢動物門的動物外，線性動物門、環(huán)節(jié)動物門和棘皮動物門的動物都具有糖苷酶活性位點E／D／S；同時，這些門類動物的i型溶菌酶具有一段特有的保守序列MDVGSLSCG（P／Y）（Y／F）QIK。

圖7 美洲大蠊i型溶菌酶二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.7 Secondary structure analysis of i－type lysozyme fromPeriplaneta americana

圖8 美洲大蠊i型溶菌酶與其他物種i型溶菌酶多序列比對結(jié)果Fig.8 Multiple alignments of Periplaneta americanai－type lysozyme with other known i－type lysozyme deduced amino acid sequences

根據(jù)美洲大蠊i型溶菌酶氨基酸序列與其他動物的c型、g型和i型溶菌酶構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（表1和圖9）結(jié)果顯示，3種不同類型的溶菌酶分成3個大的分支，其中i型溶菌酶又根據(jù)有無糖苷酶活性位點劃分為兩個分支，美洲大蠊i型溶菌酶屬于無糖苷酶活性位點分支。

表1 多序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用的序列Table1 Sequences used for multiple alignment and phylogenetic analysis

圖9 基于i型、c型和g型溶菌酶氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic analysis of the protein sequences of various i，c，and g type lysozymes

3 討論

本試驗以美洲大蠊為研究對象，通過RT－PCR和RACE PCR技術(shù)首次克隆得到其i型溶菌酶完整編碼區(qū)序列（登錄號：JQ754173），并對其氨基酸序列進(jìn)行了基本生物信息學(xué)分析。通過同源比對，該序列與黑腹果蠅和岡比亞按蚊i型溶菌酶具有同源性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，美洲大蠊i型溶菌酶與同屬節(jié)肢動物門的岡比亞按蚊、黑腹果蠅、蜜蜂、熊蜂i型溶菌酶同聚于i型溶菌酶這一分支，而且，系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果認(rèn)同了c、i溶菌酶起源于同一祖先g型溶菌酶這一說法[5]。

通過蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，它具有失穩(wěn)酶家族（Destabilase superfamily）的保守結(jié)構(gòu)域，而且它和失穩(wěn)酶的三級結(jié)構(gòu)模型也極其相似。失穩(wěn)酶（destabilase）最初發(fā)現(xiàn)存在于歐洲醫(yī)蛭，研究表明其具有異構(gòu)肽活性，能水解纖維蛋白的ε－（γ－Glu）－Lys的交聯(lián)鍵，從而使纖維蛋白發(fā)生水解[11]。后來，人們在失穩(wěn)酶中也發(fā)現(xiàn)了糖苷酶活力，于是失穩(wěn)酶被認(rèn)為是一種新的溶菌酶，進(jìn)一步被認(rèn)定為i型溶菌酶[12－13]。由于失穩(wěn)酶既具有失穩(wěn)酶活性，又具有糖苷酶活性，故稱作DL（destabilase－lysozyme）。美洲大蠊i型溶菌酶具有失穩(wěn)酶的保守結(jié)構(gòu)域，三級結(jié)構(gòu)與失穩(wěn)酶的三級結(jié)構(gòu)相似，而且本文在對不同物種i型溶菌酶的同源比對中發(fā)現(xiàn)，所有物種均具有H位點，此位點被認(rèn)為是異構(gòu)肽活性的功能位點[14]。同時，同源比對中的安德愛勝蚓（Eisenia andrei）i型溶菌酶（登錄號：ABC68610），它也具有 H位點，而且有學(xué)者對安德愛勝蚓i型溶菌酶的功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它具有異構(gòu)肽的活性，能夠切斷p－NA中的L－γ－Glu－Pna[15]，因而我們推測，美洲大蠊溶菌酶同樣具有異構(gòu)肽活性，能夠水解纖維蛋白。

結(jié)構(gòu)決定功能，溶菌酶的抑菌功能依賴于糖苷酶活力，由其自身結(jié)構(gòu)決定。c型溶菌酶有2個活性位點E、D[16]，g型溶菌酶有3個活性位點，即E和2個D[17]，而i型溶菌酶為E、D、S[16]。對安德愛勝蚓和海刺參的i型溶菌酶研究發(fā)現(xiàn)，它們具有活性位點E、D、S，功能研究也證實其具有抑菌活性[15，18]。而對不具有此活性位點的岡比亞按蚊i型溶菌酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)細(xì)菌誘導(dǎo)后的real－time定量結(jié)果并未提示其表達(dá)量的增加，但在血餐后i型溶菌酶的表達(dá)量上調(diào)，因而作者認(rèn)為i型溶菌酶可能在岡比亞按蚊消化道發(fā)揮了消化細(xì)菌的作用，也有可能是它發(fā)揮了異構(gòu)肽活性，水解纖維蛋白從而達(dá)到破壞血凝塊的目的，但作者并未進(jìn)行體外實驗研究i型溶菌酶是否具有抑菌功能[19]。有趣的是，對節(jié)肢動物門的斑節(jié)對蝦i型溶菌酶研究發(fā)現(xiàn)，它并不具備糖苷酶活性位點E、D、S，但其重組蛋白對革蘭氏陰性菌有明顯的抑菌作用[7]。本研究中的美洲大蠊i型溶菌酶并不具備糖苷酶活性位點，它是否具有抑菌活性，需要下一步的實驗才能證實。但有學(xué)者提出，或許這些功能位點并不是i型溶菌酶抑菌活性必須具備的，可能不具備這些位點它同樣具有抑菌活性[20]。

綜上所述，我們對美洲大蠊i型溶菌酶的基本特征進(jìn)行分析，并預(yù)測了其可能具備的功能。美洲大蠊i型溶菌酶具有活性位點H，推測其應(yīng)該具備異構(gòu)肽活性，能水解纖維蛋白。但它不具備抑菌活性必須的位點E、D、S，其是否具備抑菌活性，能在美洲大蠊獨特的免疫機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，還需要進(jìn)一步的試驗來證實。

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