胡美容，陳鴻軍，于圣青，仇旭升，譚 磊，高 崧，丁 鏟＊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）能引發(fā)雞慢性呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為呼吸啰音，咳嗽，流鼻涕，嚴(yán)重時(shí)可見呼吸困難[1]。為適應(yīng)營(yíng)寄生生活，MG通過調(diào)節(jié)黏附素的生物學(xué)活性來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的變化，以控制支原體入侵細(xì)胞、從細(xì)胞膜表面脫離或從細(xì)胞內(nèi)出芽釋放等過程[2]。

由于支原體基因組結(jié)構(gòu)極為簡(jiǎn)單，其在轉(zhuǎn)錄水平上的基因調(diào)控子十分有限，且普遍缺乏二元信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)[3]。在肺炎支原體（M.pneumoniae）中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子僅占0.5%，僅存在單一的Sigma因子和3種轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，支原體具備蛋白翻譯后修飾功能，以蛋白磷酸化占主導(dǎo)[5]。其中，研究最多的是磷酸糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）。該系統(tǒng)包括酶I、HPr和葡萄糖滲透酶[6]。酶I對(duì)HPr的H15位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，支原體可借助該系統(tǒng)將磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體HPr S46位點(diǎn)亦可被磷酸化修飾，而催化酶為HPr激酶（PrkC），該過程需要ATP參與[8]。這是抑制碳降解途徑關(guān)鍵性修飾過程，其逆過程由磷酸酶 PrpC（mpn247）催化[9]。PrpC是一種PPM磷酸酶（即對(duì)Mn2＋或Mg2＋依賴的蛋白磷酸酶），可對(duì)PrkC的自身磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行去磷酸化[10]。prpC與prkC同在一個(gè)基因簇上，部分基因序列重疊，含有相同的啟動(dòng)元件，表達(dá)時(shí)相一致[11]。PrkC／PrpC系統(tǒng)在細(xì)菌和支原體中均高度保守，不僅參與糖酵解酶類的磷酸化／去磷酸化，而且嚴(yán)重影響著生物被膜和芽胞形成、毒力和分裂生殖等重要的生命活動(dòng)[12]。本文克隆并突變獲得編碼雞毒支原體PrpC磷酸酶的ptc1基因，對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物的酶活性進(jìn)行細(xì)致分析，旨在建立PrpC功能檢測(cè)體系，為進(jìn)一步深入研究PrkC／PrpC調(diào)節(jié)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Rlow、大腸埃希菌DH5α和BL21（DE3）工程菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

pGEM－T Easy載體，T4DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)Promega公司；pET－28a載體，購(gòu)自 Merck公司；Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity，購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒，凝膠回收DNA試劑盒，購(gòu)自Qiagen公司；堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，CIAP）、BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；1kb DNA Marker和小分子質(zhì)量蛋白預(yù)染Marker，購(gòu)自MBI公司；支原體培養(yǎng)用Bacto heart infusion broth、Agar noble，購(gòu)自BD公司；滅活馬血清和豬血清，購(gòu)自Gibco公司；細(xì)菌培養(yǎng)用Tryptone、Yeast Extract，購(gòu)自O(shè)XOID公司；His Band Resin蛋白純化試劑盒，購(gòu)自Novagen公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 和對(duì)硝基苯 （p－NitropHenyl Phosphate Liquid Substrate System，PNPP）脂磷酸鹽溶液，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 雞毒支原體DNA提取及PCR擴(kuò)增 雞毒支原體Rlow株生長(zhǎng)于ATCC完全培養(yǎng)基中（100 mL／L滅活馬血清＋100mL／L的滅活豬血清＋100 mL／L新鮮酵母提取物），置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3d或搖床中培養(yǎng)16h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取2mL于EP管中，12000r／min離心10min，沉淀用無(wú)菌PBS洗滌3次，最后用50μL無(wú)菌PBS懸浮，煮沸10min后，冰浴5min，12000 r／min離心10min，取上清，測(cè)定DNA含量。

由于ptc1基因中含有1個(gè)編碼色氨酸的TGA三聯(lián)子，該三聯(lián)子在大腸埃希菌中為終止子，為了在大腸埃希菌中有效表達(dá)PrpC蛋白全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)中間突變引物ptc1R（AGTCTCCCACCCAGA ACGTGT）和 ptc2F （ACACGTTCTGGGTGGGAGACT）突變?cè)撐稽c(diǎn)為TGG。取100pg Rlow基因組 DNA 為模板，用Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity分兩段擴(kuò)增，ptc1基因前段（ptc1N）用引物ptc1F （CAAGGATCCATGAAAAAGATATATGCAAGTTCGAC）和ptc1R；用ptc2F和ptc2R（CAAGAATTCTTAGCCATTAATAACCTCAGTTAG）擴(kuò)增ptc1基因后半段（ptc1C），反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性2min；94℃30s，55℃30s，68℃1min，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。將ptc1N和ptc1CPCR產(chǎn)物分別回收，各取10ng作為模板，利用ptc1F和ptc2R引物擴(kuò)增ptc1基因全長(zhǎng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃30s，55℃1min，68℃2min，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pGEM T－easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取克隆酶切鑒定，取陽(yáng)性質(zhì)粒送上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.2 PrpC原核表達(dá)及純化 將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切后，與同樣酶切的pET－28a（＋）載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑菌，提質(zhì)粒酶切鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)BL21（DE3），用0.5mmol／L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波裂解（400W，工作時(shí)間5s，間歇時(shí)間5s，99次），徹底破碎細(xì)菌，12000 r／min離心15min，收集上清和包涵體。按常規(guī)方法[5]制備蛋白樣品，進(jìn)行SDS－PAGE電泳鑒定，用His Band Resin試劑盒純化表達(dá)產(chǎn)物，BCA試劑盒定量蛋白含量。

1.2.3 PrpC酶活性檢測(cè)

1.2.3.1 比活性測(cè)定 在熒光酶標(biāo)板中加入192 μL PNPP反應(yīng)底物，調(diào)節(jié) Mn2＋濃度至2mmol／L，總體積調(diào)整至200μL，每孔加入不同濃度Ptc1表達(dá)產(chǎn)物（1.5、3、4.5、6、7.5、9μg），混勻，37℃放置5 min后，測(cè)定OD405nm吸光度值。

1.2.3.2 最佳 Mn2＋濃度確定 在EP中加入192 μL PNPP反應(yīng)底物，然后依次加入不同濃度的Mn2＋（0、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5mmol／L），總體積調(diào)整至200μL，加入6μg Ptc1表達(dá)產(chǎn)物，37℃作用5min后，在多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定OD405nm吸光度值。

1.2.3.3 最適pH 確定 用 HCl／NaOH 調(diào)節(jié)酶底物反應(yīng)液（192μL PNPP，2mmol／L Mn2＋／8μL）的pH，設(shè)定pH從1到12，再加入6μg Ptc1表達(dá)產(chǎn)物，37℃作用5min后，在多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定OD 405nm吸光度值。

1.2.3.4 最適溫度確定 在不同EP管中加入200 μL酶底物反應(yīng)液（Mn2＋終濃度為2mmol／L），置于不同溫度下預(yù)冷或預(yù)熱（0、25、37、45、50、55、60℃）5 min，于各管中加入等量6μg Ptc1表達(dá)產(chǎn)物，混勻后，置于不同溫度下作用5min，分別測(cè)定其吸光度值。

1.2.3.5 不同金屬離子對(duì)酶活性影響 在不同EP管中加入200μL PNPP 反應(yīng)底物（2mmol／L Mn2＋，pH8.5），然后依次加入相同濃度的 LiCl、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、BaCl2、HgCl2、AlCl3、MnCl2溶液，混勻后，加入6μg Ptc1表達(dá)產(chǎn)物，37℃反應(yīng)5min，分別測(cè)定其吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 PrpC原核表達(dá)及純化

通過Overlap PCR擴(kuò)增獲得含點(diǎn)突變的ptc1基因。將該基因亞克隆入pET－28a（＋）載體中，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET－ptc1。用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有pET－ptc1重組質(zhì)粒的 BL21（DE3），經(jīng)SDS－PAGE鑒定，該重組蛋白呈現(xiàn)可溶性表達(dá)，經(jīng) His Band Resin試劑盒純化，獲得2mg重組蛋白，溶于1mL Elution buffer中（圖1）。

2.2 PrpC比活性測(cè)定

為了檢測(cè)可溶性表達(dá)Ptc1蛋白在體外是否具有酶活性，本實(shí)驗(yàn)以CIAP為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)底物均為200μL PNPP溶液（含2μL終濃度為2mmol／L Mn2＋），CIAP反應(yīng)孔則加入等量蒸餾水。結(jié)果可見，純化的Ptc1蛋白具有酶反應(yīng)活性。在相同條件下，Ptc1蛋白的OD值高于CIAP（圖2）。

2.3 最適Mn2＋濃度及PrpC酶反應(yīng)濃度的摸索

Mn2＋在0～2mmol／L范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，PrpC酶反應(yīng)活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng) Mn2＋≥2 mmol／L后，Ptc1蛋白的反應(yīng)活性維持在平臺(tái)期（圖3A）。因此，本試驗(yàn)選2mmol／L Mn2＋為PrpC最佳離子反應(yīng)濃度。隨后，在底物濃度不變的情況下，摸索PrpC的最適反應(yīng)酶量，結(jié)果顯示，在200μL PNPP及2mmol／L Mn2＋的底物反應(yīng)液中，Ptc1蛋白最適酶量為6μg（圖3B）。

圖2 Ptc1蛋白比活性測(cè)定Fig.2 Ptc1enzyme activity was determined

圖3 最適Mn2＋濃度及PrpC酶反應(yīng)濃度Fig.3 The determination of optimum concentrations of Mn2＋ and PrpC

2.4 最佳pH、最適溫度的確定

在確定Mn2＋反應(yīng)濃度及PrpC酶反應(yīng)量后，在反應(yīng)體系中（200μL PNPP，2mmol／L Mn2＋，6μg Ptc1蛋白）測(cè)定了PrpC的最適pH（圖4A）和最適反應(yīng)溫度（圖4B）。結(jié)果表明：PrpC的最適反應(yīng)pH為8.5，該酶為堿性磷酸酶；最適反應(yīng)溫度為37℃。

圖4 最佳反應(yīng)溫度和pH確定Fig.4 The determination of optimum reaction temperature and pH

2.5 不同金屬離子對(duì)PrpC酶活性的影響

PrpC在無(wú)Mn2＋存在下，即使加入其他金屬離子，不具有酶活性。因此，在檢測(cè)不同金屬離子對(duì)PrpC的影響時(shí)，底物反應(yīng)液中均加入2mmol／L Mn2＋。結(jié)果顯示，Ba2＋對(duì)Ptc1蛋白酶活性的影響最小，其相對(duì)活性為78.2%，Li＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋次之，K＋、Al3＋對(duì)Ptc1蛋白酶活性有較大干擾，Hg2＋能完全抑制PrpC（表1）。

表1 不同金屬離子對(duì)PrpC酶活性影響Table1 Effects of metal irons on PrpC activity

3 討論

在原核和真核生物中，蛋白可逆的磷酸化作用起著關(guān)鍵作用，如代謝途徑調(diào)節(jié)，細(xì)胞分化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13，7，3]。在真核生物體內(nèi)，絲氨酸／蘇氨酸蛋白的磷酸酶類根據(jù)其結(jié)構(gòu)、金屬離子依賴性以及對(duì)抑制劑的敏感程度等不同可分為兩大類，即PPP和PPM[14－15]。序列比較發(fā)現(xiàn)，這兩大類磷酸酶有一個(gè)共同的催化中心，即PPP的第220位氨基酸和PPM 的第290位氨基酸[15，8]。PPM 類磷酸酶的特征是在其序列中，連續(xù)或間接地有11個(gè)保守基序，其中8個(gè)基序絕對(duì)保守。PPM類磷酸酶家族中人類的PP2C最具代表性。PP2C樣酶依賴Mg2＋或Mn2＋來(lái)催化磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸殘基的去磷酸化作用[9]。PrpC是PP2C蛋白磷酸酶家族中的一員。這類酶為Mn2＋或Mg2＋依賴性，其磷酸化底物非常廣泛，包括人工合成的對(duì)硝基苯脂磷酸鹽溶液（PNPP），藍(lán)細(xì)菌的PⅡ蛋白[16]，或者是枯草桿菌的抗σ因子和翻譯延伸因子EF－G[13，17]。其中，PNPP底物在磷酸化狀態(tài)時(shí)為無(wú)色，當(dāng)其被去磷酸化后溶液則變?yōu)辄S色，底物的顏色變化可通過多功能酶標(biāo)儀在OD405nm處測(cè)定其吸光值。

本文選擇雞毒支原體PrpC（ptc1基因編碼）進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，并對(duì)其酶反應(yīng)特性進(jìn)行分析。原核表達(dá)的PrpC蛋白在體外能成功地將人工合成的磷酸化底物PNPP去磷酸化，該酶為Mn2＋依賴型，當(dāng) Mn2＋終濃度≥2mmol／L時(shí)，PrpC的活性最強(qiáng)；該酶的最適反應(yīng)pH為8.5，最適反應(yīng)溫度是37℃。1mmol／L 的 Li＋、Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2＋、Ba2＋、Al3＋、Hg2＋等金屬離子在2mmol／L Mn2＋存在下，對(duì)PrpC均有一定的抑制作用，其中Hg2＋能完全抑制其活性，在K＋、Al3＋離子存在時(shí)，PrpC的酶活性僅為20%作用，而在 Li＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋存在下，也只有約30%的活性，Ba2＋對(duì)該酶的影響最小，在Ba2＋存在下，該酶還能保留78.2%的活性。這些試驗(yàn)結(jié)果與Obuchowski M等觀察到枯草桿菌中PrpC的蛋白特性結(jié)果相似[7]。

Sebastian R S等[3]繪制了肺炎支原體磷酸化蛋白表達(dá)譜。他們通過磷酸多肽富集結(jié)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體中存在63種磷酸化蛋白，占總蛋白的近10%。P1、P30、HMW1、HMW2、HMW3等黏附素、表面未鑒定蛋白MPN474及一些代謝酶類（如烯醇化酶）均被證實(shí)可以被磷酸化。同時(shí)，他們通過Tn4001轉(zhuǎn)座子缺失篩選獲得了PrkC缺失株，并通過黏附素磷酸化修飾的Pro－Q染色－質(zhì)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了PrkC缺失株中，所有上述蛋白的磷酸化修飾喪失，與此同時(shí)，致病力亦喪失；PrkC可直接作用HMW3、P41、MPN474、MPN256、P1和HMW1等，磷酸化后修飾的HMW1和HMW3增加了與P1和表面MPN474的組裝穩(wěn)定性，PrkC缺失后，黏附蛋白解聚，不再定位于頂突中[18]。

在MG中，被鑒定的磷酸化修飾黏附相關(guān)蛋白極少。Demina I A等[2]通過磷酸多肽富集技術(shù)結(jié)合2－DIGE技術(shù)，對(duì) MG S6株可溶性蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在可溶的466種胞漿蛋白中，有1.5%的功能蛋白可被磷酸化修飾，主要是分子伴侶和翻譯調(diào)控蛋白，如 TufB、MalK／PotA、GroEL／Hsp60、DnaK、Efp等，僅有一種含量極高的血凝素／黏附素VlhA（LP64）被檢測(cè)出含磷酸化位點(diǎn)。在這些功能蛋白的磷酸化修飾過程中，PrkC／PrpC系統(tǒng)扮演著怎樣的角色？該系統(tǒng)是否參與調(diào)控雞毒支原體細(xì)胞黏附活動(dòng)關(guān)鍵蛋白的磷酸化修飾過程？這些均尚未證實(shí)。因此，對(duì)PrpC功能的研究對(duì)于雞毒支原體致病性研究具有重要價(jià)值。而這需要基于下一步構(gòu)建MG PrpC定點(diǎn)缺失株，對(duì)其生物學(xué)特性的變化來(lái)證實(shí)。

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