鄧家波，楊曉梅，王 強，李興玉，余建秋，廖黨金，牛李麗，林 毅，嚴慧娟，謝 晶

（1.成都動物園 成都市野生動物研究所，四川 成都 610081；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類一種嚴重傳染病，也是第1個實行全球性監(jiān)測的傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的傳染病。高致病性禽流感可引起禽類大批發(fā)病死亡[1－2]，同時也會感染野生鳥類和人類[3－6]。目前流行于中國大陸的禽流感病毒主要血清型是H5亞型和H9亞型，H5亞型禽流感病毒是主要的高致病性毒株，可引起禽類大批急性發(fā)病死亡[7]；H9亞型禽流感病毒多為低致病性毒株，主要引起產(chǎn)蛋下降或呼吸道癥狀[8]。近年來，禽流感在野生鳥類、動物園珍禽中也有暴發(fā)的情況[9－11]，不僅對珍稀野禽的繁育保護帶來巨大的挑戰(zhàn)，還對人的健康造成很大的威脅[12]。因此，采取有效的預(yù)防措施加強對野禽類的保護，不僅可以防止疫情的暴發(fā)，還可以保證人類的公共衛(wèi)生安全。目前最有效的措施就是免疫接種，而我國沒有專門用于珍禽的禽流感疫苗，珍禽禽流感的防控只能使用家禽禽流感疫苗[13－15]。而關(guān)于此類疫苗用于珍禽的免疫安全性及免疫效果的研究報道在國內(nèi)外都比較少。本研究擬對家禽用禽流感（H5＋H9）二價滅活疫苗免疫接種動物園成年珍禽后的血清抗體消長規(guī)律進行研究，并結(jié)合動物園的實際建立一個合理的免疫程序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 禽流感（H5＋H9）二價滅活疫苗，批號：2009008，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗用動物 成都動物園圈養(yǎng)的8種珍禽，包括孔雀6只，原雞6只，雉雞4只，白冠長尾雉6只，東方白鸛2只，斑頭雁4只，赤麻鴨2只，鴛鴦2只。

1.1.3 試劑 H5亞型禽流感抗原、陽性血清（批號分別為200901、200801）；H9亞型禽流感抗原、陽性血清（批號分別為07102101、080305），均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.4 10mL／L紅細胞懸液 采集3只未免疫禽流感疫苗的健康公雞血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2的0.01mo1／L PBS液離心洗滌3次，洗滌后用PBS配成體積分數(shù)為10mL／L紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 免疫接種 用禽流感疫苗免疫接種成都動物園圈養(yǎng)的8種珍禽，每種珍禽隨機分為2組，分別于胸肌肌肉注射0.5mL／羽和1.0mL／羽，所有免疫接種珍禽都套上腳標，做好編號。

1.2.2 血清采集 對孔雀、東方白鸛等珍禽分別在免疫接種前、免疫接種后14、21、35、90、150、222、280、340、400d（論文的表中分別用 B、A14、A21、A35、A90、A150、A222、A280、A340、A400表示免疫接種前及免疫接種后的各時間段）翅下靜脈采集試驗血液；對白冠長尾雉、赤麻鴨等珍禽分別在免疫接種前、免疫接種后14、21、35、90、126d（加強免疫時間）、二免后14、24、98、155、210d（文的表中分別用B、A14、A21、A35、A90、A126、As14、As24、As98、As155、As210表示免疫接種前、免疫接種后及二免后的各時間段）翅下靜脈采集血液，待血清析出后，8000r／min離心4min，吸出血清，同時在離心管壁標注腳標號，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體檢測 按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB／T 18936－2003）所規(guī)定的方法，分別用 H5亞型和H9亞型禽流感病毒HI標準抗原，進行免疫抗體水平檢測。

1.2.4 結(jié)果判定 以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價，只有陰性對照孔效價不大于2log2，陽性對照孔效價誤差不超過1個log2時，試驗結(jié)果才有效。按照農(nóng)業(yè)部相關(guān)標準，禽流感HI效價≥4log2判為免疫合格。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用EXCEL和SPSS16.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析比較。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

根據(jù)各種珍禽疫苗后的免疫應(yīng)答效果，即產(chǎn)生禽流感H5、H9亞型抗體的水平高低，將結(jié)果分為兩個種群，其中孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁免疫應(yīng)答結(jié)果較好，即抗體水平較高，而白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦、免疫效果則相對較差。

2.1.1 孔雀、東方白鸛等免疫應(yīng)答好的珍禽血清禽流感病毒抗體效價檢測 對動物園圈養(yǎng)的孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁4種野生珍禽，按0.5mL／羽和1.0mL／羽分成兩組分別免疫接種注射禽流感H5N1－H9N2二價滅活苗，免疫效果良好。這4種珍禽群體H5、H9亞型禽流感病毒抗體值消長規(guī)律及免疫合格率分別見表1、表2。

表1 孔雀等4種珍禽H5亞型禽流感病毒抗體值消長規(guī)律及免疫接種合格率Table1 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H5antibody in 4species of rare birds

孔雀、原雞H5亞型禽流感病毒抗體水平免疫接種前都低于4log2，斑頭雁H5亞型抗體水平免疫接種前雖然高于4log2，但免疫合格率只有50%，免疫接種后14d開始 ，4種珍禽的抗體水平均很快上升，21d抗體水平達高峰，以后抗體水平開始下降。免疫應(yīng)答好的珍禽孔雀、東方白鸛、斑頭雁H5亞型抗體在免疫接種后400d仍能維持較高效價的抗體水平，免疫合格率仍為100%，原雞在400d時也有較高的抗體水平，但280d時免疫合格率低于70%。

孔雀H9亞型禽流感病毒抗體水平免疫接種前均低于4log2，免疫接種后14d，4種珍禽抗體水平快速升高，21d以后抗體水平緩慢下降?？兹冈诿庖呓臃N后400d時，還能維持在5log2以上較高抗體水平，免疫合格率為83.33%，而原雞、東方白鸛、斑頭雁3種珍禽在免疫接種后400d時，抗體水平還維持在5log2以上水平，免疫合格率仍為100%。

2.1.2 白冠長尾雉、赤麻鴨等珍禽禽流感血清抗體效價檢測 圈養(yǎng)的白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦4種珍禽，按0.5mL／羽和1.0mL／羽分成兩組免疫注射禽流感H5N1－H9N2二價滅活苗，抗體水平較低。這4種珍禽群體禽流感H5、H9亞型抗體消長規(guī)律及免疫合格率分別見表3、表4。

表2 孔雀等4種珍禽H9亞型禽流感病毒抗體值消長規(guī)律及免疫合格率Table2 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H9antibody in 4species rare birds

表3 白冠長尾雉等珍禽H5亞型禽流感病毒抗體消長規(guī)律及免疫合格率Table3 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H5antibody in 4species rare birds

白冠長尾雉等4種珍禽H5、H9亞型禽流感病毒抗體水平在免疫接種前都很低，白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨H5亞型禽流感病毒抗體在首次免疫接種21d后升高，此后開始降低，90d時抗體水平已經(jīng)很低，而鴛鴦首次免疫接種后幾乎沒有產(chǎn)生抗體。二次加強免疫接種后，白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦4種珍禽在14d時抗體水平開始升高，在210d時，多數(shù)能保持較高的抗體水平，且有較高的免疫合格率。H9亞型禽流感病毒抗體水平在首次免疫接種后14d開始升高，其HI都不高，90d后，多數(shù)抗體水平降低到臨界值，在二次加強免疫接種后，抗體水平在14d時開始升高，24d達到高峰，在210d時，多數(shù)能維持較高的抗體水平，具有較好的免疫合格率。

2.2 免疫接種劑量試驗

用禽流感（H5＋H9）二價滅活苗兩種劑量（1.0 mL／羽和0.5mL／羽）免疫接種動物園圈養(yǎng)的8種珍禽后（本試驗選用7種珍禽作對照），其飲水、采食及精神狀態(tài)均正常，無任何明顯異常反應(yīng)。

用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，結(jié)果表明孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁兩種劑量（1.0 mL／羽和0.5mL／羽）對抗體滴度的影響差異不顯著（P＞0.05），而白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨，1.0 mL／羽和0.5mL／羽兩種劑量在首次免疫接種后對抗體滴度的影響差異多數(shù)顯著（0.01＜P＜0.05），加強免疫接種后對抗體滴度的影響差異多數(shù)不顯著（P＞0.05）。H5和 H9亞型禽流感分別用1.0 mL／羽及0.5mL／羽兩種劑量免疫的抗體消長規(guī)律見表5、表6。

表4 白冠長尾雉等珍禽H9亞型禽流感病毒免疫抗體消長規(guī)律及免疫合格率Table4 Immune antibody dynamics and antibody qualification rate of avian influenza virus H9antibody in 4species rare birds

2.3 動物園成年珍禽禽流感免疫程序的初步建立

根據(jù)禽流感（H5＋H9）二價滅活苗免疫接種動物園成年珍禽的抗體消長規(guī)律及免疫接種劑量的比較研究，并結(jié)合動物園的實際情況，初步建立成年珍禽禽流感預(yù)防的免疫程序：動物園圈養(yǎng)的孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁4種野生珍禽，免疫效果良好，可每年免疫接種1次；而免疫應(yīng)答差的珍禽白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦在首次免疫接種后1個月，用相同的疫苗加倍劑量進行加強免疫，以后每半年免疫接種1次。為了確保有效的免疫保護，并結(jié)合動物的個體情況，孔雀、原雞、東方白鸛、斑頭雁、白冠長尾雉、雉雞、赤麻鴨、鴛鴦按1.0mL／羽胸部肌肉注射或頸部皮下注射H5N1－H9N2二價滅活苗。

3 討論

用禽流感H5N1－H9N2二價滅活苗免疫接種動物園圈養(yǎng)的8種野生珍禽，大部分種類的珍禽首次免疫接種后都能同時產(chǎn)生H5和H9亞型禽流感HI抗體，但不同品種，甚至同一品種的不同個體對禽流感H5＋H9二價滅活苗的免疫反應(yīng)不同。因此，禽流感的免疫要考慮物種的差異，而且對白冠長尾雉等珍禽要定期進行監(jiān)測免疫抗體水平。

H5、H9亞型禽流感病毒HI抗體的消長規(guī)律基本同步。在免疫接種劑量相同的條件下，免疫接種前有基礎(chǔ)水平抗體的珍禽，免疫接種后產(chǎn)生的抗體水平比沒有基礎(chǔ)水平抗體的珍禽高。在研究過程中是以群體動物來看禽流感HI抗體消長規(guī)律的，是以禽流感病毒HI效價≥4log2判為免疫合格，但由于動物個體的差異，群體中某些個體可能處于沒有被保護的情況，因此，在實際生產(chǎn)中，為了更加的安全，在禽流感HI效價為5log2的時候就應(yīng)該加強免疫接種。

禽流感H5N1－H9N2二價滅活苗用于動物園的珍禽免疫接種是安全有效的，通過研究初步確定了一個對成年珍禽的免疫程序，由于動物園珍稀野生動物的特殊性，品種多，數(shù)量少，研究受到局限，該免疫程序是否最佳還需做進一步深入的研究。

[1]Hotta K，Takakuwa H，Le Q M，et al.Isolation and characterization of H6N1and H9N2avian influenza viruses from ducks in Hanoi[J].Vietnam Virus Res，2012，163（2）：448－453.

[2]Soltanialvar M，Shoushtari H，Bozorgmehrifard M，et al..Sequence and phylogenetic analysis of neuraminidase genes of H9N2avian influenza viruses isolated from commercial broiler chicken in Iran（2008and 2009）[J].Trop Anim Health Prod，2012，44（3）：419－425.

[3]Lu C Y，Lu J H，Chen W Q，et al.Potential infections of H5N1and H9N2avian influenza do exist in Guangdong populations of China[J].Chin Med J（Engl），2008，121（20）：2050－2053.

[4]Lam W Y，Yeung A C，Chu I M，et al.Profiles of cytokine and chemokine gene expression in human pulmonary epithelial cells induced by human and avian influenza viruses[J].Virol J，2010，26（7）：344.

[5]Baumer A，F(xiàn)eldmann J，Renzullo S，et al.Epidemiology of avian influenza virus in wild birds in Switzerland between 2006 and 2009[J].Avian Dis，2010，54（2）：875－884.

[6]Abolnik C，Gerdes G H，Sinclair M，et al.Phylogenetic analysis of influenza A viruses（H6N8，H1N8，H4N2，H9N2，H10N7）isolated from wild birds，ducks，and ostriches in South Africa from 2007to 2009[J].Avian Dis，2010，54（S）：313－322.

[7]Henning J，Henning K A，Morton J M，et al，Highly pathogenic avian influenza（H5N1）in ducks and in－contact chickens in backyard and smallholder commercial duck farms in Viet Nam [J].Prev Vet Med，2011，101（3－4）：229－240.

[8]Gohrbandt S，Veits J，Breithaupt A，et al.H9avian influenza reassortant with engineered polybasic cleavage site displays ahighly pathogenic phenotype in chicken [J].J Gen Virol，2011，92（Pt 8）：1843－1853.

[9]Khan O A，Shuaib M A，Rhman S S，et al.Isolation and identification of highly pathogenic avian influenza H5N1virus from Houbara bustards（Chlamydotis undulata macqueenii）and contact falcons[J].Avian Pathol，2009，38（1）：35－39.

[10]孫建忠，馬永明，韓明良.青海湖鳥島候鳥發(fā)生高致病性禽流感的防控措施[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（5）：91.

[11]梁少浪，駱旭銘，龍彩虹，等.黑天鵝高致病禽流感的診斷和預(yù)防[J].中國獸醫(yī)科技，2004（6）：67.

[12]Reperant L A，Kuiken T，Osterhaus A D.Influenza viruses：From birds to humans[J].Hum Vaccin Immunother，2012，8（1）：7－16.

[13]李興玉，王 強，楊曉梅，等.禽流感（H5＋H9）二價滅活疫苗對珍禽的免疫效果觀察[J].中國人獸共患病學(xué)報，2011，27（7）：674－676.

[14]李興玉，王 強，楊曉梅，等，動物園珍禽禽流感和新城疫免疫抗體檢測[J].畜牧與獸醫(yī)，2011，43（6）：77－79.

[15]吳艷云，史秋梅，孫好學(xué)，等.動物園動物禽流感疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測[J].中國獸醫(yī)雜志，2009（3）：85－86.