張 蘭，孫琳琳，丁 巖，宋健玲

(1.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西 西安 710004;2.市口腔醫(yī)院，陜西 寶雞 721001;3.市精神衛(wèi)生中心口腔科，江蘇 無錫 214000)

牙周病的牙周組織病損主要以牙槽骨吸收為特點(diǎn)，骨保護(hù)素(osteoprotgerin，OPG)以及核因子κB受體活化劑配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)是破骨細(xì)胞形成的必要條件，是骨代謝的最終效應(yīng)因子，在調(diào)節(jié)骨質(zhì)吸收中發(fā)揮著重要作用［1］。機(jī)體通過調(diào)節(jié)OPG和RANKL合成的比例來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和活化，以達(dá)到骨吸收的動態(tài)平衡，決定骨代謝的方向［2］。

人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPDLF)是牙周組織最重要的細(xì)胞成分，在牙槽骨的改建過程中有重要的作用，很長一段時(shí)間人們只注意到成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞對牙周組織中牙槽骨改建的影響，而忽視了HPDLF的作用。目前認(rèn)為OPG和RANKL能在HPDLF表達(dá)，眾多因素正是通過改變 HPDLF中 OPG和RANKL的合成，從而間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和成熟［3］。

牙周病時(shí)機(jī)體釋放多種細(xì)胞因子通過影響OPG和RANKL的表達(dá)來影響骨的吸收，研究證實(shí)白細(xì)胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)是介導(dǎo)牙周炎癥的主要細(xì)胞因子，在牙周病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［4］。本研究通過模擬生理及病理?xiàng)l件下不同的IL-1β濃度，采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase china reaction，RT-PCR)檢測IL-1β干預(yù)HPDLF后，OPG、RANKL mRNA表達(dá)量的變化，進(jìn)一步探討牙周病時(shí)IL-1β是如何通過調(diào)節(jié)OPG、RANKL的變化來導(dǎo)致牙槽骨吸收的機(jī)制，為OPG在臨床上有效治療牙周病造成的骨質(zhì)吸收提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

rhIL-1β(Peprotech公司，美國);胰蛋白酶、氨卞青霉素、硫酸鏈霉素 (Sigama公司，美國);胎牛血清(天津?yàn)柟?;RT-PCR試劑盒、Biozol、Bio Marker I(杭州博日公司);低糖DMEM干粉(Gibco公司，美國);SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、波形蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體(武漢博士德公司)。

1.2 HPDLF的原代培養(yǎng)及鑒定

采用組織塊法進(jìn)行 HPDLF的原代培養(yǎng)［5］。選擇12～18歲志愿者因正畸治療需要新鮮拔除的健康前磨牙，立即用無菌D-Hanks液(氨卞青霉素200 μg/mL，硫酸鏈霉素200 μg/mL)反復(fù)沖洗牙冠和牙根表面后，移入含DMEM培養(yǎng)液(不含F(xiàn)BS)的培養(yǎng)皿中，用無菌手術(shù)刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織并用眼科剪剪碎，然后將含有組織塊的DMEM培養(yǎng)液移入15 mL離心管，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入適量含200mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后，再移入預(yù)先鋪有一層半干 FBS的培養(yǎng)瓶中，倒置于 CO2培養(yǎng)箱(50 mL/L CO2、37℃、飽和濕度)中培養(yǎng)。4 h后，向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加2 mL含200 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，小心輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(勿讓組織塊漂起)繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3 d更換一次含200 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長并鋪滿瓶底約60%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。取生長良好的第5代HPDLF，以104/mL的細(xì)胞密度接種于12孔培養(yǎng)板中的蓋玻片上，待細(xì)胞融合達(dá)60% ～70%時(shí)，取出蓋玻片，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài);免疫組化SP法波形絲蛋白、角蛋白染色鑒定細(xì)胞來源。

1.3 IL-1β 對 HPDLF OPG、RANKLmRNA 表達(dá)的影響

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)處理

取生長良好的第5代HPDLF，以5.0×105/mL的密度接種于6只25 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，加入含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞充分貼壁并生長達(dá)80%匯合時(shí)，換用無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后，棄原培養(yǎng)液，將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別加入含IL-1β 終末濃度為0 ng/mL(對照組)、0.01 ng/mL(1 組)、0.1 ng/mL(2 組)、1 ng/mL(3 組)、10 ng/mL(4組)、100 ng/mL(5組)的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 RT-PCR 檢測

1.3.2.1 HPDLF 總 RNA 的提取和鑒定

選用BIOZOL常規(guī)提取HPDLF的總RNA，在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳(恒壓80 V，電泳緩沖液為1×TAE)30 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。然后取溶解后的總RNA5 μL RNA+95 μL RNase free H2O，在紫外分光光度計(jì)上分別讀取260 nm、280 nm的吸光度(OD)值。OD(260)/OD(280)≈2，說明所提取的HPDLF總RNA質(zhì)量較好，純度較高。

1.3.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

用Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)人 OPG、RANKL、β-actin的引物，經(jīng)GeneBank檢索引物序列及位點(diǎn)，并分析核實(shí)后，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA

操作在冰浴(4℃)下進(jìn)行，在PCR管中分別加5 ×RT Buffer 2.0 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L)1.0μL、Random Hexamer Primer 0.5 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、AMV Reverse Transcriptase0.5 μL、實(shí)驗(yàn)樣品 RNA 2.5 μL、RNase free H2O 3.0 μL 組成總體積 10 μL 體系，瞬時(shí)離心數(shù)秒，置于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件:25℃ 10 min、50℃ 45 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))、95℃ 5 min(滅活逆轉(zhuǎn)錄酶)、4℃ 5 min。

1.3.2.4 PCR 反應(yīng)

配制PCR反應(yīng)液:10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL、dNTP Mixture(10 mmol/L)0.5 μL、上游特異性引物(5 μmol/L)0.5 μL、下游特異性引物(5 μmol/L)0.5 μL、Taq mix DNA polymerase 0.5 μL、RT 產(chǎn)物 2.5 μL、dd H2O 18 μL，總體積 25 μL。進(jìn)行PCR反應(yīng):94℃預(yù)變性3 min后開始循環(huán)，94℃變性30 s→55℃或58℃退火30 s→72℃延長1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。退火溫度:OPG 55℃;RANKL 58℃;β-actin 55℃。

1.3.2.5 瓊脂糖凝膠電泳

向PCR產(chǎn)物(25 μL)中加入6×Loadding Buffer 5 μL，振蕩器上混勻。按照順序加入Bio Maker Ι和PCR產(chǎn)物各5 μL于凝膠孔中，電壓80 V條件下電泳50 min后，置于紫外透射儀下，采用Dolphin-1D凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、分析各條帶光密度值。以各組樣本OPG、RANKL目的基因條帶與β-actin參照基因條帶像素值之比作為OPG、RANKLmRNA表達(dá)的相對含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HPDLF 的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞爬片HE染色后光鏡觀察可見細(xì)胞呈長梭形、有長短不一的數(shù)個(gè)突起;胞體豐滿、胞漿呈粉紅色著色;單核居中，呈圓形或橢圓形、藍(lán)紫色著色、有2～3個(gè)核仁;細(xì)胞排列呈柵欄狀、旋渦狀、放射狀(圖1)。

2.1.2 免疫組化SP法染色

細(xì)胞爬片免疫組化SP法進(jìn)行波形蛋白、角蛋白染色后光鏡下可見，細(xì)胞波形蛋白染色陽性，細(xì)胞胞漿呈棕黃色(圖2);角蛋白染色陰性，細(xì)胞胞漿未呈現(xiàn)棕黃色(圖3)，結(jié)合取材部位及細(xì)胞形態(tài)觀察，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為HPDLF。

圖1 HE染色(×200)

圖2 波形絲蛋白染色陽性(×200)

圖3 角蛋白染色陰性(×200)

2.2 HPDLF總RNA的檢測

所提取的HPDLF總RNA在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察可見有兩條完整清晰的RNA電泳條帶，即28 S和18 S，且28 S條帶的亮度和寬度約為18 S條帶的兩倍，表明所提取的總RNA完整性很好(圖4)。

圖4 總RNA電泳圖

2.3 IL-1β 對 HPDLF、OPG、RANKL mRNA 表達(dá)的影響

OPG、RANKL、β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為342 bp、442 bp、179 bp(圖5)。

圖5 IL-1β干預(yù)HPDLF后各組β-actin、OPG、RANKL的電泳圖

2.3.1 不同濃度 IL-1β 對 HPDLF中 OPG mRNA的表達(dá)的影響

IL-1β在0.01～10 ng/mL濃度范圍內(nèi)均能明顯上調(diào)HPDLF中OPG mRNA的表達(dá)，各濃度組與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，其中0.1 ng/mL組上調(diào)作用最強(qiáng)，除與1 ng/mL組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，與其他各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。此后，隨著IL-1β濃度的增加，OPG mRNA的表達(dá)量逐漸減少，100 ng/mL時(shí)與對照組已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表2)。

2.3.2 不同濃度IL-1β 對HPDLF中RANKL mRNA的表達(dá)的影響

IL-1β在0.01～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)均能明顯上調(diào)HPDLF中RANKL mRNA的表達(dá)，各濃度組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而且上調(diào)作用呈濃度依賴性，即隨著IL-1β濃度的增加，RANKL mRNA的表達(dá)量也逐漸增加。各濃度組兩兩比較除10 ng/mL與100 ng/mL相比無顯著性差異(P＞0.05)外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表2)。

2.3.3 不同濃度 IL-1β 對 HPDLF中 RANKL/OPG mRNA比值的影響

除0.01 ng/mL IL-1β 組RANKL/OPG mRNA的比值與對照組(0 ng/mL)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，0.1～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)均能明顯上調(diào)RANKL/OPG mRNA比值，各組與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，而且上調(diào)作用呈濃度依賴性，即隨著IL-1β濃度升高，RANKL/OPG mRNA比值也逐漸增加。各濃度組兩兩比較，除10 ng/mL與100 ng/mL相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表2)。

表2 各組OPG、RANKL mRNA表達(dá)量及RANKL/OPG mRNA比值的比較()

表2 各組OPG、RANKL mRNA表達(dá)量及RANKL/OPG mRNA比值的比較()

不同字母組間P＜0.05

OPG RANKL RANKL/OPG對照組(0 ng/mL) 0.799 ±0.050A 0.467 ±0.031A 0.590 ±0.032組別A 1 組(0.01 ng/mL) 0.888 ±0.054BC 0.576 ±0.040B 0.642 ± 0.043B 2 組(0.1 ng/mL) 0.968 ±0.025D 0.738 ±0.033C 0.782 ± 0.038C 3 組(1 ng/mL) 0.925 ±0.047BD 0.862 ±0.039D 0.928 ±0.028D 4 組(10 ng/mL) 0.882 ±0.053BE 0.959 ±0.025E 1.128 ±0.033E 5 組(100 ng/mL) 0.835 ±0.046ACE 1.014 ±0.093E 1.182 ±0.026E

3 討論

OPG的主要功能是抑制破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡。OPG基因缺陷的小鼠中，由于破骨細(xì)胞的動員和激活亢進(jìn)而引起骨吸收增加，造成嚴(yán)重的骨密度減低，骨質(zhì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的多孔性、脆性和易骨折性，似人類的骨質(zhì)疏松癥［6］。核因子-κB受體活化劑配體(RANKL)是骨吸收的關(guān)鍵因子，除能直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和發(fā)育并參與破骨細(xì)胞功能調(diào)節(jié)外，還可通過增強(qiáng)破骨細(xì)胞的運(yùn)動能力，以及抑制破骨細(xì)胞的凋亡來間接促進(jìn)其骨吸收功能。RANKL基因敲除的小鼠會表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨硬化、牙齒萌出異常和破骨細(xì)胞缺失［7］。機(jī)體可通過調(diào)節(jié)RANKL和OPG合成的比例來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和活化，使骨吸收處于動態(tài)的平衡。

牙周組織表達(dá)OPG、RANKL，并受體內(nèi)外多種因素的調(diào)控，可通過增加或減少OPG、RANKL的表達(dá)來調(diào)控口腔局部骨組織的代謝［8］。HPDLF是牙周組織中最重要的細(xì)胞成分，在維持牙周組織的完整性、保持牙周組織改建平衡中發(fā)揮著重要作用。研究表明，在生理狀態(tài)下，HPDLF中OPG的表達(dá)明顯高于RANKL的表達(dá)，不利于破骨細(xì)胞的生成和活化，以維持牙周內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定;而在牙周病時(shí)，OPG、RANKL表達(dá)的相對水平發(fā)生改變，RANKL表達(dá)的相對水平較OPG升高，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化和成熟，導(dǎo)致牙周組織的破壞［9］。OPG、RANKL表達(dá)量的變化與破骨細(xì)胞性骨吸收密切相關(guān)，對生理性和病理性牙周組織的改變起著非常重要的作用。HPDLF可通過調(diào)節(jié)OPG和RANKL的表達(dá)影響破骨細(xì)胞的生成和活化，大多數(shù)細(xì)胞因子通過改變HPDLF中OPG和RANKL的合成，從而間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和成熟。

IL-1β是破骨細(xì)胞性骨吸收強(qiáng)有力的細(xì)胞因子，也是作用強(qiáng)大的炎性介質(zhì)，其多種生物學(xué)效應(yīng)與牙周組織的破壞直接相關(guān)，在牙周病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。體外研究表明，在牙周病的病變過程中，菌斑細(xì)菌及代謝產(chǎn)物與宿主之間相互作用，導(dǎo)致牙周組織局部IL-1β過量表達(dá)，造成牙周組織破壞［4］。牙周病病人齦溝液(gingival crevicular fluid，GCF)和牙周組織中IL-1β的含量也明顯高于健康對照組，且與病變程度呈正相關(guān)［10］。

Sakata等研究表明，IL-1β(0～3 ng/mL)呈劑量依賴性上調(diào)HPDLF中OPG的表達(dá)，0.01 ng/mL的IL-1β可影響OPG的合成，并在0.1 ng/mL時(shí)OPG的合成達(dá)到最大水平［11］。Hormdee等研究發(fā)現(xiàn)，IL-1(10 ng/mL)能夠顯著增加 HPDLF中RANKL mRNA的表達(dá)，同時(shí)也能增加OPG mRNA的表達(dá)，但I(xiàn)L-1對RANKL mRNA的作用更強(qiáng)［12］。本實(shí)驗(yàn)表明，IL-1β能上調(diào)HPDLF中OPG mRNA的表達(dá)，但這種作用不呈劑量依賴性。在0.1 ng/mL時(shí)上調(diào)作用達(dá)到最大，此后，隨著IL-1β濃度的增加OPG mRNA表達(dá)量逐漸減少，100 ng/mL時(shí)與對照組無顯著性差異。另一方面，IL-1β呈劑量依賴性上調(diào)HPDLF中RANKL mRNA的表達(dá)，0.01 ng/mL的 IL-1β可上調(diào) RANKL mRNA的表達(dá)，在100 ng/mL時(shí)達(dá)到最大。提示，在牙周炎早期HPDLF中OPG的表達(dá)增加，可抑制骨吸收，但隨著炎癥加重既IL-1β量的升高，OPG的量逐漸減少，RANKL的量逐漸增加，造成牙槽骨的快速吸收，牙周病變加重。其原因可能是:當(dāng) IL-1β作用于HPDLF時(shí)，與HPDLF表面的IL-1受體相結(jié)合從而活化蛋白激酶A和蛋白激酶C途徑，激活的蛋白激酶A促進(jìn)RANKL表達(dá)，蛋白激酶C則促進(jìn)OPG的表達(dá);與此同時(shí)IL-1β還使HPDLF合成前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)增加，PGE2間接促進(jìn)HPDLF中RANKL的表達(dá)，抑制OPG的表達(dá)。IL-1β通過兩種相反的機(jī)制調(diào)節(jié)HPDLF中OPG的表達(dá):IL-1β直接在轉(zhuǎn)錄和翻譯前水平增加OPG的表達(dá);與此同時(shí)，又通過從頭合成 PGE2抑制OPG mRNA的表達(dá)，促進(jìn)RANKL的表達(dá)，IL-1β可同時(shí)增加PGE2和OPG的合成，但是對PGE2的作用更有效［11］。故在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)低濃度的IL-1β可以促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá)，而高濃度時(shí)反而抑制OPG mRNA的表達(dá)。且與OPG的表達(dá)相比，IL-1β對HPDLF中RANKL的作用更強(qiáng)。IL-1β正是通過改變HPDLF中OPG和RANKL的合成，使RANKL/OPG比率失調(diào)，從而間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和成熟，使骨吸收大于骨形成，牙槽骨發(fā)生破壞。

本結(jié)果還提示，牙周病時(shí)隨著炎癥的加重和IL-1β含量相應(yīng)增加，OPG逐漸下降，RNAKL逐漸上升，而造成牙槽骨的持續(xù)破壞，如果能提高牙槽骨局部的OPG濃度，可有效減少牙槽骨的吸收，防止牙周病的進(jìn)一步加重。有動物實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充OPG，可預(yù)防卵巢切除術(shù)后大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生;給患有關(guān)節(jié)炎的小鼠局部注射OPG后，雖然炎癥仍存在，但能完全阻止骨量的減少［13］。Bekker等在臨床上首次使用OPG治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松病人，證實(shí)OPG可有效地抑制骨轉(zhuǎn)化［14］。Mahamed等發(fā)現(xiàn)OPG可顯著減少在糖尿病小鼠中局部接種伴放線放線桿菌而引起的牙槽骨喪失，并使RANKL的表達(dá)顯著降低［15］。由此證明OPG對骨質(zhì)的吸收有一定的治療意義。

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