孫繼軍，王愛芹，高 艷

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔內科，山東 濱州 256603)

精氨酸酶(arginase，Arg)是一種雙核含錳金屬酶，能夠催化L－精氨酸代謝生成鳥氨酸和尿素。Arg可參與細胞免疫應答和炎癥反應進程，其活性和表達的增加與血管功能紊亂及由此發(fā)生的疾病有密切的關系［1］。有研究發(fā)現，牙周炎病人唾液中Arg活性明顯高于健康者，而經基礎治療后其活性明顯降低，但是患牙部位牙齦組織中Arg的活性在治療后卻顯著升高［2］。

由于牙周組織取材困難，目前關于牙周炎中Arg表達的研究多集中在牙周炎病人的唾液和牙周炎患牙的牙齦組織中，且僅僅局限在觀察Arg活性的變化方面，至今沒有關于Arg在牙周炎部位的牙周組織分布及水平的相關報道。本研究通過建立不同時期、不同嚴重程度的大鼠牙周炎模型，獲得牙周炎的病變組織，對Arg進行免疫組化定位及半定量分析，以期進一步確定Arg在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用及其與牙周炎炎癥程度的相關性。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料和實驗動物

兔抗人、大鼠Arg多克隆抗體以及生物素標記羊抗兔IgG、辣根酶標記鏈酶卵白素、胰酶消化液(上海藍基生物科技有限公司);40只5周齡SPF級雌性Wistar大鼠(山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK魯20060099，合格證號:0009576)。

1.2 牙周炎模型的建立

取體質量(200±10)g Wistar大鼠40只，按建模時間(1、2、4、6周)隨機分4組，每組10只。水合氯醛(200 mg/kg腹腔注射麻醉后，以每只大鼠的右側下頜第一磨牙為實驗牙，分別用3－0絲線結扎其頸部并壓入齦溝內，采用自身對照的原則，左側同名牙不予處理作為正常對照。術后喂以Keyes 2000高糖粘性軟食(果糖56%，脫質奶粉28%，面粉6%，酵母4%，苜宿粉3%，動物肝粉1%，食鹽2%及少量蔬菜)［3］和高糖粘性牛奶(牛奶、水和白沙糖的體積與質量比為50∶30∶20)［4］。每日觀察記錄各組大鼠的活動狀態(tài)、體質量、飲食、糞便等變化，同時檢查結扎絲線的穩(wěn)固情況及牙周狀況。

1.3 臨床指標觀察和評價標準［5］

分別于建模后1、2、4、6周各時間點取相應組大鼠，按上述方法腹腔注射水合氯醛麻醉后，分別測量所有建模牙的松動度(TB)、齦溝出血指數(SBI)、牙周探診深度(PD)、牙槽骨吸收值(ABL)。測量由同一實驗者完成，每牙測量3次，取平均值，記錄結果。

1.3.1 牙的松動度(Tooth mobility，TB)

頰舌向松動者為1;頰舌向、近中遠中向均松動者為2;頰舌向、近中遠中向和垂直向均松動者為3。

1.3.2 牙齦出血指數(Sulus bleeding index，SBI)

用牙周探針輕探牙齦10s，不出血為0，出血為1。

1.3.3 牙周探診深度(probing depth，PD)

用牙周探針分別在頰側和腭側的近中、中間、遠中6個位點測量，取平均值。

1.3.4 牙槽骨吸收值(Alveolar bone loss，ABL)

40 g/L多聚甲醛心臟灌注處死各組大鼠后取頭顱，10 g/L亞甲基藍染色，體視顯微鏡下(4倍)測量從釉牙骨質界到牙槽嵴頂的距離，每個牙分別測量近頰、中頰、遠頰、近腭、中腭、遠腭6個位點，取均值作為該牙的牙槽骨喪失值。

1.4 病理組織學觀察

分別從建模1、2、4、6周，各組大鼠中各隨機抽取2只大鼠，40 g/L多聚甲醛液心臟灌注內固定，取左側下頜骨(連同受試牙及其牙周組織)，甲醛固定，甲酸脫鈣，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，沿牙體長釉制成頰舌向5 μm厚的組織切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察牙周組織病理變化。

1.5 免疫組化觀察

確定模型建立后，分別于結扎后 1、2、4、6周分批處死各組剩余8只大鼠，取雙側下頜骨組織塊，甲醛固定，沖洗，置100 g/L EDTA液中脫鈣1個月，漂洗，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，沿牙體長軸制作頰舌向組織切片，片厚5μm。切片經30mL/L過氧化氫液封閉內源性酶30 min，0.01 mol/L PBS洗，羊血清封閉非特異結合位點，滴加1∶100稀釋的兔抗Arg，4℃過夜，PBS洗，SP法標記相應特異性抗原，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，封片。陰性對照和空白對照分別用一抗同種血清和PBS代替一抗。

結果判定:巨噬細胞或血管內皮細胞細胞漿中出現淡黃色至棕黃色顆粒，且著色高于背景底色者為陽性，細胞胞漿內不著色或呈淺棕色背景顏色者為陰性。400倍顯微鏡下連續(xù)拍照，每個標本隨機取5個不同視野應用圖像分析系統(tǒng)進行陽性細胞計數，取均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大體觀察

肉眼觀察，各組大鼠對照側牙齦無紅腫，無糜爛，探診不出血，牙齒無松動，無骨喪失;各組結扎側1周時可觀察到結扎處牙齦發(fā)紅、探診易出血，無骨喪失，為牙齦炎期;2周時炎癥進一步加重，部分結扎牙齒牙齦糜爛，此時可探及牙周袋，牙松動Ⅰ度，可觀察到根分叉暴露，為輕度牙周炎期;4周時牙槽骨吸收加重，到根尖2/3，松動Ⅱ度，為重度牙周炎期;6周時牙周組織損害不再加重，為慢性牙周炎期。各組結扎側臨床觀察指標(表1)。

表1 各組大鼠結扎側各臨床觀察指標()

表1 各組大鼠結扎側各臨床觀察指標()

牙齦指數 牙松動度 牙槽骨吸收值 牙周探診深度牙齦炎炎癥分期 結扎時間(周)0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00輕度牙周炎 2 2.64 ±0.26 1.34 ±0.46 3.19 ±0.12 4.25 ±0.39重度牙周炎 4 3.23 ±0.44 2.41 ±0.57 3.89 ±0.19 5.01 ±0.48慢性牙周炎1 6 2.85 ±0.59 2.55 ±0.44 3.71 ±0.30 4.79 ±0.52

2.2 組織病理學觀察結果

正常對照組:附著上皮無病理性改變，牙周膜纖維排列整齊，成牙骨質細胞排列整齊，牙槽嵴無吸收，牙槽骨無破壞。牙齦結合上皮無增生，固有層極少量炎細胞浸潤(圖1)。

牙齦炎期(1周):牙齦上皮無明顯糜爛或潰瘍，結合上皮輕度增生，固有層可見明顯炎性細胞浸潤，牙周膜纖維排列正常(圖2)。

輕度牙周炎期(2周):牙齦組織炎癥明顯，結合上皮附著喪失，部分區(qū)域牙周袋壁上皮潰瘍形成，固有層大量炎細胞浸潤，牙周膜纖維排列紊亂，牙槽骨邊緣可見明顯破骨細胞和骨吸收陷窩(圖3～4)。

重度牙周炎期(4周):結合上皮附著喪失，固有層內炎性細胞浸潤，牙槽骨吸收嚴重，達根尖1/3(圖5)。

慢性牙周炎期(6周)時:牙槽骨吸收超于穩(wěn)定，骨邊緣清晰，由于大鼠再生能力強，甚至可見部分新生牙槽骨(圖6)。

2.3 免疫組化結果(圖7～10)

正常對照組牙周組織中沒有或偶見精氨酸酶(Arg)的陽性表達，而各實驗組牙周組織中，尤其是巨噬細胞中Arg的陽性表達明顯增高，陽性細胞數隨炎癥程度加重而增多 ，結扎4周(重度牙周炎)時達高峰，6周時有所下降。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(表2)。

表2 各組牙周組織中Arg陽性細胞數比較()

表2 各組牙周組織中Arg陽性細胞數比較()

不同字母組間P＜0.05

陽性細胞數正常對照組 0 0.53 ±0.43組別 結扎時間(周)A牙齦炎 1 0.73 ±0.56B輕度牙周炎 2 3.28 ±1.02C重度牙周炎 4 6.36 ±0.97D慢性牙周炎 6 4.08 ±1.10E

圖1 正常牙齦(HE，×100)

圖2 牙齦炎癥期(HE，×100)

圖3 牙周炎癥期，箭頭示固有層大量炎細胞浸潤(HE×200)

圖4 牙周炎癥期，箭頭示破骨細胞和骨吸收陷窩(HE，×200)

圖5 重度牙周炎期，牙槽骨吸收達根尖1/3(HE，×100)

圖6 慢性牙周炎期，破骨細胞和骨吸收陷窩明顯減少(HE，×100)

圖7 陰性對照表皮及固有層精氨酸酶陰性(×100)

圖8 固有層散在陽性細胞(×100)

圖9 重度牙周炎組，牙齦固有層大量陽性細胞(×200)

圖10 輕度牙周炎組，牙齦固有層散在陽性細胞(×200)

3 討論

人體內的Arg分為ArgⅠ型和ArgⅡ型，其中ArgⅠ主要存在于肝臟中，ArgⅡ作為線粒體酶在很多細胞中都有不同程度的表達［6］。本結果顯示，Arg主要在巨噬細胞和血管內皮細胞中表達，其變化趨勢為:健康牙周組織中偶有表達，牙齦炎、牙周炎時強陽性表達，到慢性牙周炎時期，表達較急性期有所降低。這主要是因為Arg的催化底物是L－精氨酸，而一氧化氮合酶 (Nitric oxide Synthase，NOS)也能夠催化L－精氨酸生成NO，也就是說Arg與NOS競爭同一底物而相互抑制:NOS分解精氨酸產生NO過程中會生成羥基－精氨酸，而羥基－精氨酸可有效抑制Arg含量;同樣，Arg可使精氨酸數量減少，而NOS的聚合和二聚均依賴精氨酸，如沒有精氨酸就會產生無活性的酶和不完整的二聚酶分子。龔斌等發(fā)現，牙齦組織內NO含量與牙齦炎癥程度呈明顯負相關［7］，本實驗中Arg含量與牙周炎癥程度呈正相關，提示Arg在牙周炎的發(fā)病機制中有重要作用?？赡芘c以下方面有關:NO是一種毒性強、不穩(wěn)定、易擴散、化學性質極其活潑、半衰期極短的自由基，參與循環(huán)、消化、免疫等多種系統(tǒng)的生理和病理過程［8］。在牙周炎時，局部活化的中性多形核白細胞能抑制NO的產生或生物學活性，導致內環(huán)境穩(wěn)定調節(jié)障礙，血管內皮破壞和微循環(huán)障礙，使牙周炎進一步發(fā)展［9］。因為NO本身具有抗菌、抗炎活性，不僅能阻止血小板凝集，調節(jié)血管平滑肌反應，保持血管間隔完整性，還可增強口腔內一些組織的血管傳導性;并能調節(jié)或調整機體的免疫功能，對維持口腔內正常菌群與宿主的共生關系及增強口腔和消化道抵抗病原微生物的能力均起到重要作用［9］。

本結果提示，牙周炎時牙齦組織中Arg的陽性計數升高，含量增加，使得牙齦組織中NO生成減少，細菌易感性升高，抵抗病原微生物的能力下降，血小板凝集，血管通透性增高，炎癥滲出物增加，加重牙齦組織的炎癥。同時Arg參與尿素循環(huán)，可催化L－精氨酸代謝產生鳥氨酸和尿素，而鳥氨酸是多胺的前體，多胺是許多細菌的營養(yǎng)物質［10］，牙周炎時牙齦組織中的Arg增加，會使代謝產物鳥氨酸含量增加，最終導致多胺生成增多，從而促進細菌生長，加重牙周炎癥疾病的進程。

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