白 玉，陳 博，，王捍國，穆云靜，孔 輝，劉向輝，余 擎

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032;2.解放軍八一醫(yī)院口腔科，江蘇 南京 210001;3.解放軍309醫(yī)院旃壇寺門診部，北京 100034)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新、多向分化能力的干細(xì)胞，其作為組織工程和組織再生領(lǐng)域極具應(yīng)用前景的種子細(xì)胞來源，受到了越來越廣泛的關(guān)注。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，諸如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)、脂肪干細(xì)胞(ADSCs)、臍血干細(xì)胞(UCBSCs)以及牙源性干細(xì)胞［1］等多種間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被有效分離、培養(yǎng)，并應(yīng)用于牙齒組織工程相關(guān)研究，其中牙源性干細(xì)胞最具優(yōu)勢。牙源性干細(xì)胞主要包括牙髓干細(xì)胞(DPSCs)、脫落乳牙干細(xì)胞(SHED)、牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)［2］和近期分離自未發(fā)育完成恒牙根尖乳頭的根尖牙乳頭干細(xì)胞(Stem cells from the apical papilla，SCAP)［3］。研究發(fā)現(xiàn) SCAP是牙根部成牙本質(zhì)細(xì)胞和根部牙髓細(xì)胞的重要來源，對根部牙本質(zhì)形成和發(fā)育起關(guān)鍵作用［4］，而PDLSCs則已被證明對牙根骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨等牙周組織的生長發(fā)育起重要作用，這兩種細(xì)胞植入免疫缺陷鼠體內(nèi)可分別形成牙本質(zhì)牙髓樣復(fù)合體和牙骨質(zhì) -牙周膜樣結(jié)構(gòu)［2-3］，預(yù)示著其在牙根、牙周組織工程和組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用前景。干細(xì)胞的遷移、增殖、分化等過程需要多種生長因子參與調(diào)控，此前已有諸多使用血小板裂解液(platelet lysate，PL)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞 MSCs的報道［5-8］，近期的研究更證實富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)［9］或 PL［10］能夠促進(jìn) DPSCs 或PDLSCs等牙源性干細(xì)胞的增殖和分化。本研究分離培養(yǎng)同一組個體來源的SCAP和PDLSCs，通過比較一定濃度的PL對在不同生長模式下干細(xì)胞增殖、礦化能力等生物學(xué)的影響，以期找到PL應(yīng)用于牙根組織工程種子細(xì)胞的適宜方式，為日后的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

改良型α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS，HYCLONE，美國);胰蛋白酶(Gbico，美國);HA-TCP(四川大學(xué)生物工程材料研究中心);抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、Alizarin Red S、Oil Red O(Sigma，美國);肝素鈉 (Roche，瑞士);SABC試劑盒(北京中杉金橋);鼠抗人Vimentin(武漢博士德);CD24多克隆抗體、FITC二抗(R＆D，美國);鼠抗人 STRO-1-APC、CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD146-PE(BIOLEGEND，美國);自動CO2培養(yǎng)箱(HERA cell，德國);倒置顯微鏡(LEICA，德國);流式細(xì)胞儀(BD，美國);掃描電鏡(HITACHI S3400N，日本)。

1.2 SCAP和PDLSCs兩種干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定

收集15～20歲志愿者(知情同意)因正畸需要而完整拔除的未發(fā)育完全的新鮮健康第三磨牙，用含雙抗的無血清α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗后，無菌條件下先后分離根尖牙乳頭，刮取根中1/3部位的牙周膜組織，采用組織塊法分離獲得原代細(xì)胞，以含200 mL/L胎牛血清、50 μg/mL抗壞血酸、2 mmol/L谷胺酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、50 mL/L CO2孵箱中。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長匯合后以胰蛋白酶(2 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA)消化收集細(xì)胞，按1∶3傳代。取對數(shù)生長期的P1代細(xì)胞以有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆，待克隆長至96孔板孔底80%后，取多個克隆培養(yǎng)的細(xì)胞胰酶消化混合，擴(kuò)大培養(yǎng)。收集P3代相同個體來源的SCAP和PDLSCs，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞儀檢測 Vimentin、STRO-1、CD24、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146 等特定抗原的表達(dá);同時對細(xì)胞成脂、礦化誘導(dǎo)后，分別行Oil Red O染色及Alizarin Red S染色，鑒定細(xì)胞多向分化能力。

1.3 血小板裂解液的制備

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院輸血科選取新鮮采集的ACD-A抗凝血小板10人份，參考并改進(jìn)文獻(xiàn)［10-11］的方法，將血小板混勻后以生理鹽水重懸，去除血漿等雜質(zhì)，使血小板濃度達(dá)1×109/mL;將所獲樣本經(jīng)-80℃與37℃反復(fù)凍融3次(每次間隔12 h)，使血小板內(nèi)生長因子充分釋放。凍融裂解產(chǎn)物900 g離心30 min取上清即為血小板裂解液，用0.22 μm濾器過濾后分裝于無菌EP管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆茫褂们?7℃水浴融解，以不同體積比加入培養(yǎng)基中。

1.4 PL對SCAP和PDLSCs在體內(nèi)、外增殖和礦化能力的影響

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)體系

以礦化誘導(dǎo)液(含100 mL/L胎牛血清、50 μg/mL抗壞血酸，10-6mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、2 mmol/L谷胺酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按表1以相應(yīng)體積比加入1.3中所得的PL制成條件培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入2 IU/mL的肝素以防止PL中的凝血因子與培養(yǎng)基中的組分反應(yīng)生成凝膠［11］(表1)。

1.4.2 PL對SCAP和PDLSCs在體外三維培養(yǎng)模式下增殖的影響

取直徑5 mm，厚1.5 mm，孔徑50 ～300 μm，孔隙率為52%的HA-TCP支架材料，經(jīng)高溫高壓滅菌后浸泡于FBS內(nèi)置4℃冰箱過夜，取出后于超凈臺內(nèi)室溫干燥備用。參考文獻(xiàn)報道方法［12］，收集P4至P5代相同個體來源的SCAP和PDLSCs，分別制成3×106/mL的細(xì)胞懸液后分裝于離心管內(nèi)，并于每1.5 mL細(xì)胞懸液內(nèi)浸入10片HA-TCP支架材料，置搖床上在37℃、50 mL/L CO2環(huán)境內(nèi)以70 r/min振蕩搖晃2 h，待細(xì)胞均勻接種粘附后，小心取出支架材料置24孔板內(nèi)，每孔一片，隨機(jī)分為3組，分別按表1所示加入相應(yīng)的培養(yǎng)體系，連續(xù)培養(yǎng)28 d，每2 d換液1次，分別于培養(yǎng)的第1、7、14、21、28 天取出各組樣本，0.01 mol PBS洗3遍，25 mL/L戊二醛固定，乙醇梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.4.3 PL對SCAP和PDLSCs體內(nèi)移植模式下增殖、分化的影響

參考并改進(jìn)文獻(xiàn)報道方法［13-14］，收集 P4至P5代相同個體來源的SCAP和 PDLSCs，分別以5×105/皿的密度接種于6 cm直徑培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞貼壁并生長至融合后，隨機(jī)分為3組，分別按表1所示加入相應(yīng)的培養(yǎng)體系，于37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d后分別將各組所形成的SCAP和PDLSCs細(xì)胞膜片完整刮下并移入另一培養(yǎng)皿，再重復(fù)該步驟兩次以獲得3張細(xì)胞膜片，小心重疊后包裹于經(jīng)FBS預(yù)濕的HA-TCP支架材料表面。然后取6～8周齡雌性裸鼠，在腹腔注射麻醉下，將上述經(jīng)細(xì)胞膜片包裹的HA-TCP支架材料植入裸鼠背部皮下。常規(guī)飼養(yǎng)8周后取材，40 g/L多聚甲醛固定，EDTA脫鈣2周，環(huán)氧樹脂包埋后切片，行Van Gieson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 SCAP和PDLSCs的分離、純化和鑒定

原代SCAP和PDLSCs細(xì)胞在1～3 d內(nèi)爬出組織塊，細(xì)胞體積較小，多數(shù)為成纖維樣細(xì)胞，其中SCAP呈梭形或多角形(圖1a);PDLSCs呈均一的細(xì)長梭形(圖1b)?？寺』囵B(yǎng)并傳至第3代的SCAP和PDLSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(圖2)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色(圖3a，d，e)顯示所獲得細(xì)胞在細(xì)胞表型上符合SCAP或PDLSCs的特征。成脂誘導(dǎo)5周，倒置相差顯微鏡觀察，可見細(xì)胞Oil Red O脂滴染色陽性(圖3b，f);礦化誘導(dǎo)4周，茜素紅染色后，鏡下可見礦化結(jié)節(jié)形成(圖3c，g)。

2.2 PL對SCAP和PDLSCs復(fù)合HA-TCP支架材料體外三維培養(yǎng)模式下增殖的影響

掃描電鏡低倍視野(圖4Ⅰ，Ⅱ)可見在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，除了對照組的PDLSCs外，其余各處理組細(xì)胞均能隨培養(yǎng)時間的延長逐漸在HA-TCP支架材料表面和孔隙間形成較為連續(xù)完整的細(xì)胞膜片樣結(jié)構(gòu)。SCAP各處理組間(圖4Ⅰ)，在培養(yǎng)初期(1～7 d)，細(xì)胞膜片的面積和完整度呈現(xiàn)50 mL/L PL組＞10 mL/L PL組＞對照組的規(guī)律，提示50 mL/L PL組細(xì)胞生長情況優(yōu)于10 mL/L PL組和對照組;在培養(yǎng)中后期(14～28 d)，因各組樣本表面均為細(xì)胞膜片完全覆蓋，故未觀察到明顯差異。PDLSCs各處理組間(圖4Ⅱ)，在整個培養(yǎng)周期的各時間點，細(xì)胞膜片的面積和完整度均顯示50 mL/L PL組＞10 mL/L PL組＞對照組，提示PL對PDLSCs的促增殖效應(yīng)更具濃度相關(guān)性。

高倍視野(圖4Ⅲ，Ⅳ)下可見:各處理組SCAP和PDLSCs均能良好的粘附于HA-TCP支架材料表面，伸展充分(圖4Ⅲ A～C;Ⅳ A～C)。SCAP各處理組(圖4Ⅲ)從7 d開始細(xì)胞均生長密集至融合，進(jìn)入復(fù)層生長狀態(tài)，50 mL/L PL組和10 mL/L PL組均觀察到有明顯的礦化細(xì)胞外基質(zhì)形成，隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組從21 d開始也觀察到形成礦化細(xì)胞外基質(zhì)，但是少于同時期的50 mL/L PL組及10 mL/L PL組，提示了 PL對SCAP的促進(jìn)礦化作用。PDLSCs各處理組(圖4Ⅳ)在7 d時細(xì)胞仍圍繞孔隙或跨孔隙交錯生長，未進(jìn)入復(fù)層生長狀態(tài)，但50 mL/L PL組及10 mL/L PL組已可觀察到有明顯的礦化細(xì)胞外基質(zhì)形成;直至14 d時50 mL/L PL組及10 mL/L PL組細(xì)胞方進(jìn)入復(fù)層生長狀態(tài)，而同期的對照組細(xì)胞仍保持培養(yǎng)初期的生長狀態(tài);在培養(yǎng)中后期(14～28 d)，相對于對照組，50 mL/L PL組及10 mL/L PL組樣本能夠觀察到更多的礦化細(xì)胞外基質(zhì)，提示了 PL對PDLSCs同樣具有促進(jìn)礦化的效應(yīng)。

2.3 PL對SCAP和PDLSCs體內(nèi)移植模式下異位生成硬組織能力的影響

組織學(xué)觀察顯示(圖5)，裸鼠體內(nèi)移植8周后，經(jīng)50 mL/L PL及10 mL/L PL體系預(yù)刺激的SCAP樣本(圖5A～B)在HA-TCP支架材料表面和孔隙間形成了牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)，可觀察到牙本質(zhì)樣基質(zhì)(d)、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(od)和牙髓樣組織(Pulp)，而且50 mL/L PL組形成的牙本質(zhì)樣基質(zhì)的連續(xù)性和礦化程度均高于10 mL/L PL組;而在對照組(圖5C)，HA-TCP支架材料表面和孔隙內(nèi)可觀察到成骨細(xì)胞(ob)及礦化程度較高的新生骨組織(b)。經(jīng)50 mL/L PL體系預(yù)刺激的PDLSCs樣本(圖5D)可觀察到新生的牙骨質(zhì)樣基質(zhì)(C)、成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(CB)和牙周膜樣組織(PDL);而10 mL/L PL組(圖5E)觀察到的是成骨細(xì)胞(ob)及礦化程度較高的新生骨組織(b);在對照組(圖5F)除了觀察到條索狀的纖維結(jié)締樣組織外，未發(fā)現(xiàn)明顯的新生硬組織。提示在體外預(yù)刺激后體內(nèi)移植的模式下，PL對于SCAP和PDLSCs的干預(yù)效應(yīng)具有特定的濃度相關(guān)性。

圖2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的表面抗原特征表型，P2，P3表示抗原陽性區(qū)域(A為SCAP;B為PDLSCs)

圖4 掃描電鏡觀察SCAP及PDLSCs生長于HA-TCP支架材料上第1、7、14、21、28天的情況

圖5 組織學(xué)觀察各組樣本植入裸鼠背部皮下8周后的情況(Van Gieson染色，×100)

3 討論

自我更新和多向分化能力是干細(xì)胞的重要特征及突出優(yōu)勢，但干細(xì)胞的這些能力并不是無限的。由于受目前研究技術(shù)水平所限，在體外分離、長期大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用干細(xì)胞的過程中尚不能復(fù)制出與體內(nèi)完全一致的微環(huán)境，有可能對干細(xì)胞造成各種不利影響，從而使其自我更新及分化能力發(fā)生變化甚至逐漸喪失。同時，由于干細(xì)胞分化的多向性及其調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，即使能夠為其營造出定向分化的環(huán)境，比如礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，可是一旦細(xì)胞脫離該環(huán)境比如移植進(jìn)入體內(nèi)后，就無法很好地對其施加持續(xù)的、多因素聯(lián)動的分化調(diào)控，從而無法保證干細(xì)胞一定會向目標(biāo)細(xì)胞分化。雖然目前針對以上問題已進(jìn)行了諸多研究并取得了一定的進(jìn)展，但是這些技術(shù)手段在實際應(yīng)用中存在著諸如花費昂貴，操作不便等缺點。因此，考慮建立一種在大規(guī)模擴(kuò)增的同時，亦能維持干細(xì)胞特性的培養(yǎng)條件就顯得非常必要。

血小板富集物應(yīng)用于干細(xì)胞培養(yǎng)或臨床治療的嘗試目前已獲得了生物學(xué)理論和大量基礎(chǔ)研究成果的支持［9，15］。但僅通過評價血小板富集物在干細(xì)胞增殖及促進(jìn)組織愈合再生方面的作用，尚不能確定其所有的相關(guān)機(jī)制［19，15-18］。加之目前已報道的各種血小板富集物提取方法差別較大，無法形成規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)流程，所采用的動物模型標(biāo)準(zhǔn)也不一致，更增加了我們從中歸納出較可靠結(jié)論的難度。但可以確定的是:研究過程中生長因子的種類、劑量和干預(yù)方式起著至關(guān)重要的作用［19］。牙源性干細(xì)胞分化由諸多與成骨相關(guān)的因素調(diào)控，包括TGF-β家族成員和其他多種生長因子［20-22］。PL是血小板富集物經(jīng)細(xì)胞裂解后的產(chǎn)物，其去除了殘余細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低了免疫原性，保留了其中的多種液態(tài)生長因子如 PDGF、TGF-β、FGF、EGF 和正常 T 細(xì)胞表達(dá)和分泌增強(qiáng)調(diào)節(jié)因子等，而這些生長因子均被證實能促進(jìn)骨的再生修復(fù)［23-24］。

牙的生長發(fā)育也受參與其中的干細(xì)胞種類和分化能力的調(diào)控，分離自未發(fā)育完成恒牙根尖乳頭的根尖牙乳頭干細(xì)胞(SCAP)和牙周韌帶組織的牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)同為間充質(zhì)來源干細(xì)胞，被認(rèn)為與牙根相關(guān)組織生長發(fā)育和再生密切相關(guān)。目前已有諸多分別針對這兩種細(xì)胞的研究，但是將SCAP和PDLSCs置于同一研究模型內(nèi)進(jìn)行比較尚屬探索階段。有鑒于僅僅應(yīng)用血小板富集物尚無法啟動牙源性干細(xì)胞的礦化［9］，本研究立足礦化誘導(dǎo)的微環(huán)境，利用體外接種HA-TCP支架材料三維培養(yǎng)和動物體內(nèi)移植的實驗?zāi)Ｐ?，通過引入PL作為生長因子來源，以期促進(jìn)SCAP及PDLSCs體內(nèi)外增殖和成骨-成牙本質(zhì)定向分化，達(dá)到增強(qiáng)組織再生和修復(fù)能力的目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn):在連續(xù)4周的體外三維培養(yǎng)模式下，PL能促進(jìn)SCAP和PDLSCs的增殖、礦化細(xì)胞外基質(zhì)形成，并有助于在支架材料上形成完整細(xì)胞膜片(cell sheet)樣結(jié)構(gòu)。這提示在體外礦化誘導(dǎo)的微環(huán)境內(nèi)，PL的參與更能保持三維生長條件下SCAP和PDLSCs持續(xù)自我更新特性，同時增強(qiáng)其礦化能力。利用體外先期持續(xù)刺激后再植入體內(nèi)的模式，觀察到經(jīng)50 mL/L PL、10 mL/L PL培養(yǎng)體系干預(yù)的SCAP能形成了包含成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞、牙本質(zhì)樣基質(zhì)和牙髓組織的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu);相較對照組僅形成礦化骨樣基質(zhì)，經(jīng)PL處理組顯然更符合牙體組織再生的應(yīng)用目標(biāo)。同樣，PDLSCs經(jīng)50 mL/L PL先期刺激后植入體內(nèi)可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，并生成牙骨質(zhì)樣基質(zhì)和牙周膜樣組織，從而更貼近牙周組織再生要求。以上結(jié)果提示，一定體積濃度比的 PL在 SCAP和PDLSCs體內(nèi)外增殖、定向分化中可能起到促進(jìn)作用，在牙組織工程領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

［1］Huang GTJ，Gronthos S，Shi S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.those from other sources:their biology and role in regenerative medicine ［J］.J Dent Res，2009，88(9):792-806.

［2］Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364(9429):149-155.

［3］Sonoyama W，Liu Y，Yamaza T，et al.Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth:a pilot study ［J］.J Endodont，2008，34(2):166-171.

［4］Banchs F，Trope M.Revascularization of immature permanent teeth with apical periodontitis:new treatment protocol?［J］J Endod，2004，30(4):196-200.

［5］Doucet C，Ernou I，Zhang Y，et al.Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion:a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications ［J］.J Cell Physiol，2005，205(2):228-236.

［6］Schallmoser K，Bartmann C，Rohde E，et al.Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells ［J］.Transfusion，2007，47(8):1436-1446.

［7］Bieback K，Hecker A，Koca?mer A，et al.Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow ［J］.Stem Cells，2009，27(9):2331-2341.

［8］Capelli C，Gotti E，Morigi M，et al.Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate［J］.Cytotherapy，2011，13(7):786-801.

［9］Lee UL，Jeon SH，Park JY，et al.Effect of platelet-rich plasma on dental stem cells derived from human impacted third molars［J］.Regen Med，2011，6(1):67-79.

［10］Govindasamy V，Ronald VS，Abdullah AN，et al.Human platelet lysate permits scale-up of dental pulp stromal cells for clinical applications［J］.Cytotherapy，2011，13(10):1221-1233.

［11］Müller AM，Davenport M，Verrier S，et al.Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue［J］.Tissue Eng Part A，2009，15(4):869-875.

［12］Zhang W，Walboomers XF，van Kuppevelt TH，et al.The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials ［J］.Biomat，2006，27(33):5658-5668.

［13］Iwata T，Yamato M，Tsuchioka H，et al.Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model［J］.Biomat，2009，30(14):2716-2723.

［14］Tsumanuma Y，Iwata T，Washio K，et al.Comparison of different tissue-derived stem cell sheets for periodontal regeneration in a canine 1-wall defect model［J］.Biomat，2011，32(25):5819-5825.

［15］El Backly R，Ulivi V，Tonachini L，et al.Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response［J］.Tissue Eng Part A，2011，17(13-14):1787-1800.

［16］Intini G.The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy［J］.Biomat，2009，30(28):4956-4966.

［17］Chen FM，Zhang J，Zhang M，et al.A review on endogenous regenerative technology in periodontal regenerative medicine［J］.Biomat，2010，31(31):7892-7927.

［18］Chen FM，Zhang M，Wu ZF.Toward delivery of multiple growth factors in tissue engineering ［J］.Biomat，2010，31(24):6279-6308.

［19］Ferreira CF，Carriel Gomes MC，F(xiàn)ilho JS，et al.Platelet-rich plasma influence on human osteoblasts growth［J］.Clin Oral Implants Res，2005，16(4):456-460.

［20］Kettunen P，Karavanova I，Thesleff I.Responsiveness of developing dental tissues to fibroblast growth factors:expression of splicing alternatives of FGFR1，-2，-3，and of FGFR4;and stimulation of cell proliferation by FGF-2，-4，-8，and-9［J］.Dev Genet，1998，22(4):374-385.

［21］Shiba H，F(xiàn)ujita T，Doi N，et al.Differential effects of various growth factors and cytokines on the syntheses of DNA，type I collagen，laminin，fibronectin，osteonectin/secreted protein，acidic and rich in cysteine(SPARC)，and alkaline phosphatase by human pulp cells in culture［J］.J Cell Physiol，1998，174(2):194-205.

［22］Onishi T，Kinoshita S，Shintani S，et al.Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor［J］.Arch Oral Biol，1999，44(2):361-371.

［23］Schilephake H.Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction［J］.Int J Oral Maxillofac Surg，2002，31(5):469-484.

［24］Marx RE，Carlson ER，Eichstaedt RM，et al.Platelet-rich plasma:growth factor enhancement for bone grafts［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，1998，85(6):638-646.