蔡梁婧，邰佰霞，王永蘭，郭宏磊，朱志穎

(天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070)

Ⅱ型糖尿病是僅次于年齡、牙石的第三位牙周炎危險(xiǎn)因素［1］。目前，Ⅱ型糖尿病的發(fā)病人群已不再局限于中老年人，而是呈現(xiàn)低齡化趨勢，甚至在兒童時(shí)期就已存在糖尿病前期的狀態(tài)。糖尿病前期是一種處于葡萄糖代謝正常與糖尿病之間的中間階段，又稱為糖調(diào)節(jié)受損。研究顯示:糖尿病前期人群進(jìn)展為糖尿病的比例明顯高于普通人群［2－3］。糖尿病與牙周病發(fā)病存在共同危險(xiǎn)因素且互為高危因素，研究表明:在局部刺激因素相似的情況下，有糖尿病者的牙周病發(fā)生率和嚴(yán)重程度均大于無糖尿病者［1］。目前，牙齦炎在兒童、青少年中的患病率為70% ～90%，而控制不佳的牙齦炎可發(fā)展為牙周炎，且早期牙齦炎也可因臨床表現(xiàn)不明顯，易誤認(rèn)為正常牙周組織而延誤治療。牙齦炎主要受細(xì)菌活動(dòng)性的影響，但也可受全身狀況的影響。因此，進(jìn)一步明確牙齦炎的危險(xiǎn)因素，有效地預(yù)防和控制牙齦炎的發(fā)生、發(fā)展顯得尤為重要。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

無水乙醇、去離子水、Na2EDTA·2 H2O、(北京Solarbio公司);瓊脂糖、SuperMix、Trans100bp、DNA Marker(北京Transgen公司);通用引物、特異性引物(北京Sunbiotech公司);口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(北京Tiangen公司);紫外分光光度儀、超凈工作臺(tái)、微量加樣器、低溫超速離心機(jī)、振蕩器(Eppendorf公司，德國);PCR擴(kuò)增儀(美國AB公司);恒溫水浴箱HWT－6、電泳儀、電泳槽、自動(dòng)凝膠成像分析儀(北京六一設(shè)備有限公司)等。

菌種來自于首都醫(yī)科大學(xué)，分別為 Pg ATCC33277 、Fn ATCC25586 、Tf ATCC43037 、Pi ATCC25611、Aa ATCC24523。

1.2 受試對象選擇

以到天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院接受口腔健康檢查的6～14歲兒童為對象，知情同意并由天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)后，進(jìn)行如下檢查。

1.2.1 血糖檢測

分別采集所有參試者晨起空腹和口服75 g葡萄糖后2 h的靜脈血各5 mL，以葡萄糖氧化酶法測量空腹血漿血糖(FBG)和攝糖后的血漿血糖(OGTT2hBG)含量。并參照WHO關(guān)于糖代謝分類標(biāo)準(zhǔn)［4］，以 FBG=5.6 ～ 6.1 mmol/L，OGTT2hBG ＜7.8 mmol/L或 FBG ＜ 7.0 mmol/L，OGTT2Hbg＞7.8 mmol/L且 ＜11.1 mmol/L 者診斷為糖尿病前期。FBG ＜5.6 mmol/L，OGTT2Hbg＜7.8 mmol/L者診斷為血糖代謝正常。

1.2.2 牙周檢查

由3名經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)合格(Kappa值＞0.7)的牙周科醫(yī)生檢查所有參試者的PD、SBI、PLI等牙周各臨床指標(biāo)，并參照文獻(xiàn)［5］，以探診出血且PD≤3 mm，無附著喪失者診斷為牙齦炎;以無探診出血且PD≤3 mm，無附著喪失者診斷為牙周健康。

1.2.3 研究對象確定

根據(jù)以上檢查和診斷標(biāo)準(zhǔn)，分別選取糖尿病前期且伴有牙齦炎者(實(shí)驗(yàn)組)30例，其中男17例，女13例，平均年齡(9.31±1.73)歲;血糖代謝正常但有牙齦炎者(單純牙齦炎對照組)30例，其中男14例，女16 例，平均年齡(9.83 ±1.52)歲;血糖代謝正常且牙周健康者(正常對照組)30例，其中男16例，女14 例，平均年齡(10.25 ±1.36)歲(表1)。

排除標(biāo)準(zhǔn):①3個(gè)月內(nèi)使用抗生素;②有呼吸、消化、泌尿等系統(tǒng)或身體其他部位的炎癥感染;③有其他嚴(yán)重全身疾病及并發(fā)癥;④半年內(nèi)接受牙周治療，包括齦上潔治術(shù)、根面平整術(shù)、牙周手術(shù)等;⑤經(jīng)牙周檢查有嚴(yán)重口腔疾病，或存在附著喪失;⑥由于個(gè)人原因無法完成檢查者。

表1 各組牙周臨床指標(biāo)()

表1 各組牙周臨床指標(biāo)()

臨床指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組 單純牙齦炎組 正常對照組PLI 2.30 ±0.84 2.04 ±0.71 1.98 ±0.54 SBI 1.13 ±1.07 1.04 ±1.07 0.81 ±0.22 PD 1.62 ±0.43 1.41 ±0.27 1.21 ±0.11

1.3 牙周可致病菌檢測

1.3.1 齦下菌斑樣本采集

以所有受試對象的上頜第一恒磨牙和恒切牙為受檢牙，隔濕并吹干牙面后，用無菌刮匙仔細(xì)去除齦上菌斑后，用齦下刮匙插入齦溝底采集齦下菌斑，立即放入裝有1 mL PBS的離心管中，冷凍(－70℃)保存?zhèn)錂z。

1.3.2 菌斑DNA提取及其純度測定

采用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒并參照其說明書的操作步驟提取菌斑DNA，然后用紫外分光光度儀測量在260 nm和280 nm處的吸光度(OD值)并計(jì)算比值。比值介于1.7～2.0表示DNA純度良好適合PCR檢測要求。同時(shí)按照下列公式計(jì)算濃度:DNA濃度(μg/mL)=OD260×50×稀釋倍數(shù)。

1.3.3 引物合成

5種微生物的引物均來自16SrRNA的基因，由北京奧柯生物技術(shù)有限公司合成(表2)。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)體系:SuperMix 12.5 μL，引物(10 U)2 μL，無菌雙蒸水 9.5 μL，細(xì)菌 DNA 1 μL，總體積25 μL。

反應(yīng)條件:通用引物、Pg、Fn、Tf特異性引物的反應(yīng)條件是:94℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入主循環(huán)，包括36個(gè)循環(huán):94℃變性45 s，55～60℃退火60 s，72℃延伸60 s，最后72℃延伸7 min;Aa、Pi引物的反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，36個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。

1.3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用20 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，DNA染料為EB，紫外燈下觀察并用自動(dòng)凝膠成像分析儀拍照。每批PCR擴(kuò)增設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。所有試驗(yàn)樣本的測定均在盲法下進(jìn)行，并隨即抽取10%的樣本做重復(fù)試驗(yàn)檢測PCR結(jié)果的可靠性。

應(yīng)用電泳凝膠成像分析軟件(Fluorchem V2.0)分析各個(gè)電泳條帶的平均灰度值(AVG)。細(xì)菌特異引物與該菌斑通用引物的PCR產(chǎn)物比值為該細(xì)菌的相對含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖1～5)

2.2 各組齦下菌斑中牙周可疑致病菌檢出率(表3)

5種可疑致病菌的檢出率均以實(shí)驗(yàn)組(糖尿病前期)最高，其次為單純牙齦炎組，但與實(shí)驗(yàn)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);而正常對照組最低，與其他兩組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

圖1 Pg特異性引物檢測電泳圖

圖2 Pi特異性引物檢測電泳圖

圖3 Aa特異性引物檢測電泳圖

圖4 Fn特異性引物檢測電泳圖

圖5 Tf特異性引物檢測電泳圖

表3 各組齦下菌斑中牙周可疑致病菌檢出率比較(%)

2.3 齦下菌斑中牙周可疑致病菌的相對含量(表4)

5種可疑致病菌的相對含量均以實(shí)驗(yàn)組最高，其次為單純牙齦炎組，但與實(shí)驗(yàn)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);而正常對照組最低，與其他兩組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

表4 各組齦下菌斑中牙周致病菌的相對含量比較(%，)

表4 各組齦下菌斑中牙周致病菌的相對含量比較(%，)

#與實(shí)驗(yàn)組比較P＞0.05;*與其他兩組比較P＜0.05

檢測菌 糖尿病組 單純牙齦炎組 正常對照組Pg 30±12 31±12# 21±10*Aa 26±15 19±11# 16±11*Fn 18±11 19±12# 17±12*Pi 19± 4 23± 9# 8± 6*Tf 32±10 28±12# 20±18*

2.4 實(shí)驗(yàn)組齦下菌斑中牙周可疑致病菌的相對含量與牙周臨床標(biāo)之間的關(guān)系

Pg的相對含量與PD、SBI以及FBG存在相關(guān)性(P ＜0.05);Pi的相對含量與 PD、SBI、FPG、口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2 h血糖(OGTT2hBG)存在相關(guān)性(P＜0.05);Aa和Fn的相對含量與SBI、PD存在相關(guān)性(P＜0.05);Tf的相對含量與 SBI、PD、FBG存在相關(guān)性(P＜0.05)(表5)。

表5 實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌相對含量與牙周臨床指標(biāo)和血糖水平的相關(guān)性分析 (r值)

3 討論

有研究認(rèn)為:牙周病的發(fā)生是由特定的牙周致病菌感染引起的，在這些牙周致病菌中Pg、Tf、Td、Aa、Pi等均有報(bào)道［8－9］。目前，有很多研究報(bào)道了糖尿病伴成人牙周炎與牙周致病菌的相關(guān)性，但是以糖尿病前期的兒童牙齦炎病人為研究對象，用PCR法檢測牙周致病菌的研究，尚未見報(bào)道。由于牙齦炎有可能發(fā)展為牙周炎，因此及時(shí)治療牙齦炎對預(yù)防牙周炎至關(guān)重要。然而，在牙周炎初期，牙周探診深度和附著喪失等變化不明顯，早期發(fā)現(xiàn)和診斷牙周炎有一定困難。另外，臨床檢查只能發(fā)現(xiàn)已經(jīng)發(fā)生的牙周破壞，而菌斑中細(xì)菌種類和數(shù)量的變化卻先于臨床改變，因此檢測齦下菌斑中牙周可疑致病菌可幫助判斷疾病的活動(dòng)性、評價(jià)宿主的易感性、預(yù)測疾病的發(fā)生和發(fā)展［9－10］。有鑒于此，本研究選擇牙周病發(fā)病關(guān)系密切的Pg、Aa、Tf、Fn、Pi 5種牙周致病菌為目標(biāo)菌，用PCR方法對糖尿病前期并患有牙齦炎的6～14歲的兒童齦下菌斑進(jìn)行檢測，探討上述可疑致病菌與牙周臨床指標(biāo)和空腹血糖之間的關(guān)系，為牙周炎的預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)。

齦下菌斑尤其是非附著齦下菌斑是牙周炎發(fā)生的始動(dòng)因子，與宿主共同組成動(dòng)態(tài)平衡的牙周生態(tài)系。當(dāng)牙周微生物與宿主之間失去平衡，便可導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生。研究表明:牙周健康時(shí)齦下菌斑以G+菌為主;牙齦炎時(shí)G－和G+菌并存;與慢性牙周炎發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的非附著齦下菌斑中以G－厭氧菌為主［11］。本研究發(fā)現(xiàn) Pg、Aa、Fn、Tf、Pi在實(shí)驗(yàn)組的齦下菌斑中均可檢出，可見在兒童Ⅱ型糖尿病前期伴牙齦炎病人齦下菌斑中包括專性和兼性厭氧菌。5種可疑致病菌的檢出率均以實(shí)驗(yàn)組最高，但與單純牙齦炎組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，可以認(rèn)為此時(shí)的血糖變化未引起致病菌的種類和數(shù)量的顯著變化，可能是因?yàn)閮和挲g較小，處于血糖代謝異常狀況的時(shí)間還較短，齦下菌斑中可疑致病菌對牙周組織的影響效果還未顯現(xiàn)出來。另外，因本研究樣本較難獲取，故樣本量偏小，也可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。

Pg是慢性牙周炎的主要病原因子，Pg在誘發(fā)牙周組織的炎癥反應(yīng)后更易在局部微環(huán)境內(nèi)生存，從而對牙周組織產(chǎn)生進(jìn)一步的破壞［12］。本研究中Ⅱ型糖尿病前期兒童牙齦炎病人Pg的檢出率和相對含量為(46.67，30 ±12)%，且與 PD、SBI、以及 FBG存在顯著相關(guān)性(P＜0.05)，說明Pg在Ⅱ型糖尿病前期伴牙齦炎患兒的齦下菌斑中的含量與牙周臨床指標(biāo)密切相關(guān)，較單純牙齦炎病人更易發(fā)展為牙周炎。有研究顯示:青少年和年輕成年人檢出Pg等紅色復(fù)合體微生物者存在感染牙周病的風(fēng)險(xiǎn)［13］。Aa菌對牙周組織的致病作用包括降低宿主免疫力，促進(jìn)骨吸收和組織破壞，本研究中，實(shí)驗(yàn)組Aa的相對含量與PD、SBI有顯著相關(guān)性。較多報(bào)道認(rèn)為PI與中、重度牙齦炎、急性壞死性潰瘍性牙齦炎和妊娠性齦炎有關(guān)［14］，可在齦袋、冠周炎等部位中檢出。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組Pi的相對含量與SBI、PD、FBG和OGTT2hBG存在顯著相關(guān)性(P＜0.05)。Tf是目前公認(rèn)的牙周炎證據(jù)最為充分的3大主要致病菌之一，與牙周附著喪失明顯相關(guān)［15－16］。在本研究中實(shí)驗(yàn)組Tf的檢出情況與PD、SBI、FBG存在顯著相關(guān)性。Klein 等［17］發(fā)現(xiàn):PD≤5 mm 時(shí)，Pi、Tf的聯(lián)合檢出率為30%;當(dāng)PD＞5 mm時(shí)，兩細(xì)菌聯(lián)合檢出率為90%。另外有研究顯示:血糖控制良好的糖尿病病人與控制不良的病人間牙周探診出血指數(shù)［(2.9±0.4)VS(3.1 ±0.5)，P ＜0.05］和附著喪失差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(1.7 ±1.5)mm VS(2.8 ±2.3)mm］，說明血糖水平與其牙齦炎癥的程度和牙周破壞的程度相關(guān)，并提示對于伴糖尿病的牙周病病人必須有效地控制血糖才能消除或減少糖尿病對牙周病的影響，反之牙周炎的系統(tǒng)治療也將有利于血糖的控制［18］，均與本研究結(jié)果一致。Fn的相對含量與PD、SBI存在一定的相關(guān)性，但是與FBG、OGTT2hBG之間不存在相關(guān)關(guān)系，可能是由于Fn是不分解糖的細(xì)菌，不能直接利用糖進(jìn)行新陳代謝，因此FBG、DGTT2hBG變化可能對Fn數(shù)量影響不大。

根據(jù)本研究結(jié)果可認(rèn)為:對于Ⅱ型糖尿病前期患兒，要保證其良好的口腔衛(wèi)生，防止牙齦炎的發(fā)生;對已患牙齦炎的Ⅱ型糖尿病前期患兒，要控制其血糖水平，積極治療牙齦炎以防止牙周炎的發(fā)生。

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