鄭瀾 王小月 吳越 林麗容 田旭 吳秀山

1湖南師范大學(xué)體適能與運(yùn)動康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖南 長沙 410012） 2湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心

心臟結(jié)構(gòu)和功能的增齡改變是心臟病的主要危險(xiǎn)因素，適宜的體育運(yùn)動延緩心臟結(jié)構(gòu)和功能的退行性變化已為一些研究證實(shí)［1，2］，然其作用的分子機(jī)理尚未闡明。以哺乳動物為模型研究生理?xiàng)l件下運(yùn)動對心臟功能的影響及機(jī)理，存在實(shí)驗(yàn)動物壽命較長、基因組復(fù)雜的局限。果蠅是唯一具有心臟的無脊椎動物，且心臟組織分化精細(xì)，是研究心臟遺傳與發(fā)育基因調(diào)控的理想模式動物。由于果蠅生命周期短、表型易于觀察、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，以果蠅為模型進(jìn)行心臟衰老的研究有明顯優(yōu)勢。對果蠅的研究表明胰島素信號通路和飲食限制對衰老的影響具有進(jìn)化上的保守性［3-5］，果蠅在鉀離子通道影響心臟衰老進(jìn)程保守性的研究中也扮演重要的角色［6，7］。近年研究亦表明，果蠅可作為研究更高種屬心臟的非自律結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)心臟節(jié)律、心肌收縮的模型［8］，抗氧化酶Sod2突變果蠅心臟功能衰退與果蠅生命后期心臟功能表型相似［9］。這些研究進(jìn)展為果蠅作為研究脊椎動物乃至人類心臟衰老的模式動物提供了有力證據(jù)。本研究根據(jù)果蠅逆重力爬行的生理特性，在研制果蠅運(yùn)動平臺裝置的基礎(chǔ)上，研究不同運(yùn)動方案對果蠅運(yùn)動能力、心臟功能及生命周期的影響，探討抗心臟衰老果蠅運(yùn)動模型的建立。

1 材料與方法

1.1 果蠅及分組

采用野生型w1118品系果蠅（由Rolf Bodmer教授和Karen Ocorr教授惠贈，湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心保存），擴(kuò)大培養(yǎng)后收集12 h內(nèi)羽化雄性果蠅3600只，隨機(jī)分為6組：空白對照組、1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組和3.5 h運(yùn)動組，600 只 ／組，20 只 ／管，恒溫 25℃、濕度 50%、12小時(shí)晝夜循環(huán)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)在湖南師范大學(xué)體適能與運(yùn)動康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 果蠅培養(yǎng)基

先將玉米粉504 g、黃豆粉120 g置于鍋內(nèi)加水6.0 L，水溫?zé)岷蠹?08 g瓊脂至完全溶化，小火加熱至沸騰略帶粘稠后再加入酵母糊149 g、麥芽糖370 g、蔗糖370 g充分?jǐn)嚢柚梁隣睿煌；?～2 min，加入丙酸20 ml、20 g對羥基苯（溶于200 ml無水乙醇），充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶盅b于潔凈的培養(yǎng)指管中，每管培養(yǎng)基厚度為0.5～1.0 cm。

1.3 運(yùn)動方案

采用平臺運(yùn)動 （果蠅平臺運(yùn)動裝置由課題組自主研制），8天齡開始執(zhí)行運(yùn)動方案，培養(yǎng)指管底部培養(yǎng)基至棉塞下端預(yù)留8 cm作為果蠅運(yùn)動區(qū)域，運(yùn)動頻率由運(yùn)動裝置的電機(jī)轉(zhuǎn)速控制，運(yùn)動頻率（運(yùn)動裝置電機(jī)轉(zhuǎn)速）為24秒/轉(zhuǎn)。1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組和3.5 h運(yùn)動組周一至周五，每天分別運(yùn)動 1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 和 3.5 h，共3周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 運(yùn)動能力檢測

每次訓(xùn)練前采用視頻拍攝測定攀爬指數(shù)評定果蠅運(yùn)動能力，攀爬指數(shù)評定方法：試管底部至棉塞下端預(yù)留18 cm作為果蠅運(yùn)動區(qū)域，此運(yùn)動區(qū)域由底至上分 1、2、3、4、5、6、7、8、9 九等份（區(qū)域），每個(gè)區(qū)域 2 cm， 各區(qū)域相應(yīng)得分為 1、2、3、4、5、6、7、8、9分。從全部果蠅個(gè)體震落至試管底部后第5秒時(shí)，計(jì)算各區(qū)域內(nèi)果蠅個(gè)體數(shù)，重復(fù)5次震落并計(jì)數(shù)各區(qū)域果蠅個(gè)體數(shù)。每組隨機(jī)取樣100只，分為5管，每管20只，計(jì)算每管每只果蠅得分之和為攀爬指數(shù)，以評定運(yùn)動能力。

1.4.2 生命周期檢測

運(yùn)動結(jié)束后，各組取果蠅200只，每2天更換一次新鮮培養(yǎng)基，每天定時(shí)觀察，記錄果蠅死亡數(shù)，直到各組果蠅全部死亡為止，制作果蠅半數(shù)死亡時(shí)間曲線和存活曲線。死亡前一半果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為半數(shù)死亡時(shí)間，全部果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為平均壽命，最后20只果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為最長壽命，平均延壽率（%）＝（運(yùn)動組平均壽命－空白對照組平均壽命）/空白對照組平均壽命×100%。統(tǒng)計(jì)各組果蠅平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間、最長壽命和平均延壽率。

1.4.3 心臟功能檢測

運(yùn)動結(jié)束后，分別于果蠅31天齡、38天齡時(shí)進(jìn)行心臟功能檢測。將果蠅置于麻醉瓶（內(nèi)含三酰胺麻醉劑，F(xiàn)lyNapTM）麻醉5分鐘后，取出整齊排列在兩側(cè)涂有導(dǎo)電膠（Signa gel，美國Parker公司）的載玻片上，使果蠅翅膀朝上翻轉(zhuǎn)貼于導(dǎo)電膠，頭尾分別與兩側(cè)導(dǎo)電膠相連。用脈沖電激儀（PHIPPs&BIRD，美國；測試參數(shù)：6 Hz、40 V）循環(huán)交流電刺激30 s后立即停止，2 min內(nèi)在解剖顯微鏡下觀察果蠅心臟跳動變化與心率恢復(fù)。

（1）功能正常心臟：有節(jié)律地收縮跳動；（2）纖維性震顫：心臟處于一種非正常狀態(tài)，常表現(xiàn)為劇烈收縮、回旋或者緩慢蠕動等不正常行為；（3）心臟停止跳動。有上述（2）或者（3）表現(xiàn)的果蠅心率不能恢復(fù)正常，視為心力衰竭［10，11］。 分別計(jì)數(shù)心臟纖維性震顫或停止的果蠅數(shù)與果蠅總數(shù)的百分比，即心臟衰竭率。每組檢測果蠅100只。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，顯著性水平為α=0.05和α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 果蠅攀爬指數(shù)

圖1顯示，果蠅攀爬指數(shù)隨著年齡的增加而下降。運(yùn)動第1周、第2周，1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組、3.5 h運(yùn)動組攀爬指數(shù)與空白對照組相比變化不大，第3周，2.5 h運(yùn)動組果蠅攀爬指數(shù)明顯大于其他各組。

圖1 不同運(yùn)動方案對果蠅攀爬指數(shù)隨年齡變化的影響

2.2 生命周期

表1顯示，與空白對照組相比，2.5 h運(yùn)動組平均壽命增加（P=0.0095），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組、3.5 h運(yùn)動組無變化；與空白對照組相比，3.5 h運(yùn)動組半數(shù)死亡時(shí)間縮短（P=0.0218），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組無變化；與空白對照組相比，1.5 h運(yùn)動組 （P=0.0094）、2 h運(yùn)動組（P=0.0089）、2.5 h 運(yùn)動組（P=0.0074）、3 h 運(yùn)動組最長壽命（P=0.0098）都出現(xiàn)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3.5 h運(yùn)動組無變化。1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組、3.5 h運(yùn)動組平均延壽率分別為 1.36%、2.87%、5.86%、2.80%、-0.85%。

圖2顯示，與空白對照組相比，1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組果蠅半數(shù)死亡時(shí)間曲線上移、右移，3.5 h運(yùn)動組半數(shù)死亡時(shí)間曲線下移、左移。

圖3顯示，與空白對照組相比，1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組果蠅存活曲線上移、右移，3.5 h運(yùn)動組存活曲線下移、左移。

表1 不同運(yùn)動方案果蠅壽命比較

圖2 不同運(yùn)動方案果蠅半數(shù)死亡時(shí)間曲線

圖3 不同運(yùn)動方案果蠅存活曲線

2.3 心臟功能

表2顯示，31天齡時(shí)，空白對照組、1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組、3.5 h運(yùn)動組果蠅心臟衰竭率分別為 56%、58%、52%、46%、57%、69%；38天齡時(shí)，空白對照組、1.5 h運(yùn)動組、2 h運(yùn)動組、2.5 h運(yùn)動組、3 h運(yùn)動組、3.5 h運(yùn)動組果蠅心臟衰竭率分別為 71%、68%、65%、62%、74%、80%。

表2 果蠅心臟衰竭率檢測結(jié)果

3 討論

果蠅以不定向飛行運(yùn)動為主，如何讓其根據(jù)規(guī)定的運(yùn)動方向持續(xù)運(yùn)動成為對果蠅實(shí)施運(yùn)動方案首先需要解決的問題。本研究前期根據(jù)果蠅逆重力爬行的生理特征，自主研制了果蠅運(yùn)動平臺裝置（已申請國家發(fā)明專利），通過觀察果蠅的運(yùn)動情況和身體狀況，設(shè)置平臺由8.5 cm高落下，所產(chǎn)生的沖擊力可使果蠅震落至培養(yǎng)指管底部，果蠅將自主運(yùn)動至培養(yǎng)指管頂部棉塞處，選擇24秒重復(fù)1次，實(shí)現(xiàn)了果蠅運(yùn)動時(shí)間與頻率可控的定向運(yùn)動，以研究5種不同持續(xù)時(shí)間的運(yùn)動方案對果蠅運(yùn)動能力、生命周期和心臟功能的影響。

常用攀爬指數(shù)評價(jià)果蠅運(yùn)動能力［12］，也可評估果蠅隨增齡發(fā)生的身體活動能力的變化［13，14］。本研究中，果蠅從8天齡開始運(yùn)動（相當(dāng)于人的青春發(fā)育初期），進(jìn)行5種不同方案運(yùn)動，每天分別運(yùn)動1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，在運(yùn)動第 1 周、第 2 周，各運(yùn)動組攀爬指數(shù)與空白對照組相比變化不大，第3周，各組果蠅攀爬指數(shù)呈下降趨勢，但2.5 h運(yùn)動組果蠅攀爬指數(shù)明顯大于其他各組，表明隨著年齡的增加，每天運(yùn)動2.5 h作為適宜的運(yùn)動，對維持果蠅運(yùn)動能力、抵抗增齡衰退的效果顯現(xiàn)出來。果蠅生命周期結(jié)果顯示，持續(xù) 3 周、每天運(yùn)動 1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 的果蠅，其存活曲線和半數(shù)死亡時(shí)間曲線上移、右移，而3.5 h運(yùn)動組果蠅存活曲線和半數(shù)死亡時(shí)間曲線下移、左移。僅每天運(yùn)動2.5 h果蠅的平均壽命增加，而運(yùn)動3.5 h的果蠅半數(shù)死亡時(shí)間縮短 （P<0.05），且每天運(yùn)動 1.5 h、2 h、2.5 h、3 h可增加果蠅的最長壽命 （P<0.01），1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 各運(yùn)動組平均延壽率分別為1.36%、2.87%、5.86%、2.80%，而3.5 h運(yùn)動組平均延壽率為-0.85%。持續(xù)3周、每天2.5 h的運(yùn)動可作為果蠅延長生命周期的適宜運(yùn)動，而每天運(yùn)動3.5 h可能過量運(yùn)動，會縮短生命周期。

正常老年人隨年齡增長心臟功能下降［15］，逐漸出現(xiàn)心律失常和心力衰竭［16，17］。年齡相關(guān)的心功能不全和心力衰竭的哺乳動物模型因其壽命較長和心臟正常功能是存活所必需的條件，進(jìn)行心臟衰老機(jī)理的研究有較大局限性。與嚙齒類動物相比，果蠅壽命只有數(shù)周（約2個(gè)月），果蠅機(jī)體所需氧氣由氣管系統(tǒng)供應(yīng)完成，心臟處于危險(xiǎn)狀況不會導(dǎo)致個(gè)體過早死亡［17，18］。 故本研究應(yīng)用果蠅心力衰竭模型，將 31天齡、38天齡的成體果蠅放在導(dǎo)電的載玻片上，通過電極短暫刺激30秒，使果蠅的心跳頻率由正常的3 Hz增加到6 Hz，停止后檢測果蠅心率恢復(fù)情況，不能恢復(fù)正常心跳頻率或出現(xiàn)纖維性震顫的果蠅視為心力衰竭。該模型可檢測年齡與心力衰竭發(fā)生的相關(guān)性，判斷心臟功能隨增齡而衰退的變化［10，11］。 持續(xù)3周、每天運(yùn)動1.5 h至2.5 h的果蠅在31天齡和38天齡時(shí)其心臟衰竭發(fā)生率下降，每天運(yùn)動2.5 h的果蠅心臟衰竭發(fā)生率明顯下降，而每天運(yùn)動3.5 h的果蠅心臟衰竭發(fā)生率明顯高于空白對照組，表明從8天齡開始，進(jìn)行持續(xù)3周、每天1.5 h至2.5 h的運(yùn)動可緩解果蠅心臟衰竭的發(fā)生，延緩心臟功能隨增齡而衰退，其中以每天2.5 h的運(yùn)動效果最佳，每天超過3 h的過量運(yùn)動不利于維護(hù)心臟功能。

因此，建議采用每天2.5 h、持續(xù)3周的運(yùn)動方案建立抗心臟衰老果蠅運(yùn)動模型，進(jìn)行運(yùn)動延緩衰老的基因功能篩選和機(jī)理研究。

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