焦廣發(fā) 高峰 李秀楠 鄧曉茜 張海峰 何玉秀

1河北體育學院（河北 石家莊 050041） 2河北師范大學體育學院

嬰幼兒時期是生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，外界營養(yǎng)因素可以對機體能量代謝的調(diào)節(jié)活動產(chǎn)生程序化的作用。 1998 年，Lucas［1］提出“營養(yǎng)程序化（nutritional programming）”，即發(fā)育關(guān)鍵期或敏感期的營養(yǎng)狀況將對機體各器官功能產(chǎn)生長期甚至終生的影響。Waterland［2］認為程序化的主要機制可能是通過早期營養(yǎng)誘導器官結(jié)構(gòu)的改變和細胞數(shù)目的改變。研究發(fā)現(xiàn)，幼兒6歲開始脂肪迅速積累，使該時期的脂肪細胞數(shù)量增加與其成年后體成分的變化密切相關(guān)［3］。脂肪組織瘦素（Leptin）和腫瘤壞死因子（TNF-α）等細胞因子以及過氧化物增殖因子激活的受體（PPAR-γ）控制著脂肪細胞的能量代謝狀態(tài)和增殖分化狀態(tài)。Leptin與其他外周激素作為信號物質(zhì)參與機體能量平衡機制的調(diào)控，影響程序化的形成［4］。本實驗通過觀察大鼠生長發(fā)育關(guān)鍵時期（3周斷乳幼齡期）進行運動干預對其體內(nèi)脂肪含量產(chǎn)生的長期效應，分析脂肪組織相關(guān)基因改變在其中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

10周齡清潔級SD純系大鼠購自河北省動物實驗中心，生產(chǎn)許可證編號SCXK冀2008-1-003。實驗地點為河北師范大學實驗中心，使用許可證編號SYXK （冀）2008-0026（換發(fā)），動物合格證編號811005。適應性喂養(yǎng)1周后，按雌雄2∶1合籠。孕鼠分娩后，選取每窩仔鼠數(shù)目在10～12只的母鼠和仔鼠（剔除體重過高或過低的仔鼠），按每籠雌雄仔鼠各6只的數(shù)量標準分籠，母鼠喂養(yǎng)21天后斷乳。選取3周齡雄性幼鼠，隨機分為對照組（C組），安靜喂養(yǎng)到12周齡；運動3周組（E3組），游泳3周后安靜喂養(yǎng)到12周齡；運動9周組（E9組），游泳9周到12周齡。每組各12只。

實驗室內(nèi)濕度控制在50±5%，溫度控制在（23±2）℃，自然光照，自由飲水攝食。大鼠采用清潔自來水和國家標準大鼠混合飼料飼養(yǎng)。動物飼料由河北省動物實驗中心提供。

1.2 運動方案

參考Ploug［5］游泳運動方案，根據(jù)預試驗結(jié)果制定本實驗運動方案：第1周為每天30分鐘，每周增加15分鐘，至第3周為60分鐘，每周增加5分鐘，至第9周為90分鐘，到實驗結(jié)束。水深50 cm，每只大鼠有200 cm2的活動面積，水溫保持在（35±1）℃。每天游泳1次，每周6天。大鼠按實驗計劃完成運動，無意外死亡。

1.3 取材

大鼠12周齡、停止運動48 h、空腹8 h后腹腔注射0.5%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉。心臟取血，制備血清，－20℃保存?zhèn)溆?。每組有半數(shù)大鼠經(jīng)生理鹽水心臟灌流后，剪開腹腔取附睪和腎周脂肪墊稱重，－80℃保存?zhèn)溆?；剩余大鼠?jīng)生理鹽水心臟灌流后，繼續(xù)用4%多聚甲醛灌流，取腎周脂肪墊置于多聚甲醛固定液中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清指標測試

血糖（GLU）測定采用德國Keysys全自動生化分析儀自動完成，所有樣本測試在同一批次內(nèi)完成。采用競爭型放射免疫法測試胰島素（INS），試劑盒購于中國原子能科學研究所。Leptin采用ELISA-ABC法在芬蘭Labsystems公司W(wǎng)ellscan MK2型酶標儀上測試，試劑盒購于美國Millipore公司。

1.5 內(nèi)臟脂肪量計算

取附睪脂肪墊和腎周脂肪墊，電子天平稱重，計算脂體比。 脂體比［6］＝［附睪脂肪墊重量（g）＋腎周脂肪墊重量（g）］/體重（g）×100%。

1.6 脂肪細胞數(shù)目的檢測

取適量甲醛固定的腎周脂肪組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。每張切片用IPP軟件在400倍視野下取4個視野，計數(shù)所有完整脂肪細胞。每組取6個樣本，每個樣本取兩張切片進行計數(shù)。

1.7 脂肪組織目的基因表達水平測定

取400～500 mg組織放入玻璃勻漿器，加l ml TRIzol，提取脂肪組織總RNA。進行總RNA完整性分析和含量測定后，采用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應體系（20 μl）：Total RNA 0.5 μg，Oligo （dT）18 primer 1 μl，5× Reaction Buffer 4 μl，Ribolock Rnase Inhibitor 1 μl，10 mM Dntp Mix 2 μl，ReverAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μl， 加 DEPC-treated water至 20 μl。 反轉(zhuǎn)錄反應條件：42℃ 60 min，70℃ 5 min。

根據(jù)NCBI-Nucleotide數(shù)據(jù)庫檢索目的基因序列，引物采用Primer5.0軟件設(shè)計，由上海英濰捷基（invitrgoen）公司合成，PCR引物見表1，內(nèi)參引物為GAPDH。按Takara公司Real-time RT PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）配制PCR擴增反應體系，在Applied Biosystems（ABI 7000）定量 PCR 儀上擴增。擴增反應條件：95℃，10 s，1 Cycle；95℃，5 s，60℃，30 s，40 Cycle。反應結(jié)束后分析熔解曲線和擴增曲線，擴增產(chǎn)物單一，線性關(guān)系良好，進行定量分析。

表1 各目的基因引物序列和擴增產(chǎn)物量

每個樣本采用3孔擴增，各孔樣本CT值與內(nèi)參結(jié)果比較后，再與第1孔對照組樣本進行比較，計算方法為2－△△CT法，由PCR儀自帶軟件自動完成。每組取6個樣本，重復2次，取每次擴增的平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

在SPSS11.5統(tǒng)計軟件上進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（）表示。Real time PCR 結(jié)果使用Wilcoxon非參數(shù)檢驗。脂肪細胞數(shù)目比較采用卡方檢驗。采用方差分析（ANOVA）進行不同組間其他指標比較，先進行正態(tài)分布檢驗，若有顯著性差異且方差齊性再進行LSD多重比較。設(shè)定顯著性水平，P<0.05表示差異具有顯著性，P<0.01表示差異具有非常顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體重、內(nèi)臟脂肪墊重量和脂體比

分組時各組實驗大鼠體重無統(tǒng)計學差異，實驗期間各組大鼠體重平穩(wěn)增長，生長發(fā)育良好，見圖1。表2顯示，12周齡時，E9組大鼠體重低于C組，差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.05），E3組與C組無統(tǒng)計學差異，但高于 E9組（P<0.05），見表 2。E3組和 E9組大鼠內(nèi)臟脂肪墊重量和脂體比顯著低于C組（P<0.01和P<0.01），E3組和E9組無統(tǒng)計學差異。

圖1 實驗期間各組大鼠體重變化

表2 12周齡時各組大鼠內(nèi)臟脂肪墊重量和脂體比比較（n=6）

2.2 脂肪細胞數(shù)目

12周齡時各組大鼠脂肪細胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計學意義，C組顯著低于E3組和E9組 （P<0.01），E3組顯著低于E9組（P<0.05），見圖2。固定視野下各組大鼠脂肪細胞數(shù)目差異（圖3）顯示，E3組脂肪細胞體積小于C組，E9組小于E3組。

圖2 12周齡時各組大鼠脂肪組織切片脂肪細胞數(shù)目比較（×400視野下）

圖3 12周齡各組大鼠脂肪組織石蠟切片（HE染色，×400）

2.3 血清指標

表3 12周齡時各組大鼠血清指標比較（n=6）

表3顯示，各組大鼠血清GLU和INS差異無統(tǒng)計學意義，表明幼齡期進行3周和9周游泳運動對大鼠血糖、胰島素無明顯影響，提示大鼠機體內(nèi)能量代謝處于平衡狀態(tài)。E9組大鼠血清Leptin顯著低于C組（P<0.05），E3組與C組無統(tǒng)計學差異，但顯著高于 E9 組（P<0.01）。

2.4 脂肪組織相關(guān)基因表達

圖4顯示，E3組和E9組大鼠脂肪組織Leptin mRNA表達水平均顯著低于C組 （P<0.05），E3組與E9組之間差異無統(tǒng)計學意義。E9組大鼠PPAR-γ mRNA表達水平顯著低于C組 （P<0.05），E3組低于C組但無統(tǒng)計學意義，E3組與E9組之間差異無統(tǒng)計學意義。E3組和E9組TNF-α mRNA表達水平顯著高于C組（P<0.05），但E3組和E9組之間差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

程序化理論認為，出生后的環(huán)境因素可在生長發(fā)育關(guān)鍵期產(chǎn)生潛在性的作用，并在成年時期放大代謝性疾病的風險［7］。生長發(fā)育早期營養(yǎng)改變可對機體糖脂代謝產(chǎn)生長期的影響，蛋白攝入超過正常代謝需要，可使胰島素和IGF-1分泌增加，同時增加脂肪合成和脂肪細胞分化，因此高蛋白飲食易引發(fā)嬰兒肥胖［8］。運動可消耗機體的能量，改變組織能量貯存狀態(tài)，進而引起不同器官和組織細胞內(nèi)基因表達的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，長期運動后幼齡大鼠體重和體內(nèi)脂肪含量未出現(xiàn)嚴重反彈現(xiàn)象［9］，因此推測幼齡時期運動對機體脂肪組織代謝活動具有長期穩(wěn)定的程序化影響。

圖4 12周齡各組大鼠脂肪組織基因表達水平的比較

汪軍等［10］研究發(fā)現(xiàn)，長期運動減慢大鼠體重增長，減少體內(nèi)脂肪含量。本實驗中9周運動大鼠體成分變化與前述研究基本一致。本研究結(jié)果顯示，斷乳后幼齡期3周游泳運動干預大鼠體內(nèi)脂肪含量與連續(xù)9周運動大鼠無差異，且顯著低于不運動大鼠。研究發(fā)現(xiàn)，在出生前后的發(fā)育關(guān)鍵時期，不同喂養(yǎng)條件可決定大鼠成年后的體重。蛋白質(zhì)、不同脂肪酸及其他微量元素的攝入均可對大鼠成年后體重、脂肪含量以及某些疾病發(fā)病率產(chǎn)生顯著影響［11，12］。綜合分析本研究12周齡時大鼠體重、內(nèi)臟脂肪墊重量、脂體比以及400倍視野下脂肪細胞數(shù)目結(jié)果，認為E3組大鼠體內(nèi)脂肪量低于C組，但脂肪量高于E9組。這表明大鼠幼齡期進行3周運動降低了其成年時（12周齡）體內(nèi)脂肪含量的積累，提示幼齡發(fā)育關(guān)鍵期的短期運動對大鼠成年時的體成分有長期的影響。

本研究還發(fā)現(xiàn)，運動3周大鼠脂肪組織Leptin表達水平低于不運動對照組大鼠，但血清Leptin含量與對照組無差異。Leptin是最早被發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子之一，通過中樞和外周機制降低脂肪細胞內(nèi)脂肪的積累。60分鐘的中等強度運動后脂肪組織Leptin分泌量無變化，但有下降趨勢［13］。長期運動降低血Leptin水平，但脂肪組織Leptin表達水平變化不確定［14］。本研究中，長期運動大鼠脂肪組織和血清Leptin表達和含量均低于對照組。其他組織細胞也表達和分泌Leptin［15］，有學者分析認為運動后Leptin的降解機制不同［16］，因此運動3周停止后的12周齡大鼠脂肪組織Leptin mRNA表達下降，但血清Leptin含量未下降。這可能是其他組織分泌Leptin以及運動停止后Leptin降解速率減慢的綜合結(jié)果。經(jīng)過3周游泳運動后的幼齡大鼠在12周齡時，其脂肪組織Leptin表達低于對照組，但與9周連續(xù)游泳運動大鼠一致。在斷乳后進行短期和長期運動均使Leptin表達下降，提示幼齡期短時間的運動對Leptin表達可產(chǎn)生持續(xù)的抑制作用。

本研究觀察到，幼齡期運動3周大鼠脂肪組織TNF-α表達水平高于不運動對照大鼠，而PPAR-γ表達水平無差異。但幼齡期9周游泳運動大鼠脂肪組織PPAR-γ表達下降，并與幼齡期3周游泳運動大鼠無明顯差異，提示幼齡期進行游泳運動可能通過PPAR-γ抑制脂肪細胞的增殖分化。PPAR-γ是調(diào)節(jié)脂肪酸攝取和氧化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。本實驗中，9周運動組大鼠脂肪含量較低，可能也是引起PPAR-γ表達下降的重要原因。PPAR-γ和TNF-α是與脂肪細胞增殖分化關(guān)系密切的核轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子［17，18］。 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，5 周齡大鼠進行 12周游泳運動后，安靜狀態(tài)下脂肪組織TNF-α表達水平無明顯變化［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，3周齡大鼠進行3周和9周運動后，脂肪TNF-α表達水平均升高，且兩組之間無差異，說明3周齡進行運動對脂肪組織TNF-α表達有特殊影響。因此，推測幼齡期3周的運動對大鼠脂肪組織TNF-α表達產(chǎn)生長期的影響，是大鼠體內(nèi)脂肪含量未顯著增加的機制之一，生長發(fā)育關(guān)鍵時期進行運動對脂肪組織TNF-α表達水平有長期調(diào)節(jié)作用。

4 總結(jié)

大鼠幼齡期3周游泳運動使其在12周齡時仍保持較低的體脂量，脂肪組織Leptin和TNF-α基因表達改變可能是這一現(xiàn)象的生物學機制。

［1］Lucas A.Programming by early nutrition：an experimental approach.J Nutr，1998，128（Suppl）：401S-406S.

［2］Waterland RA，Garza C.Potential mechanisms of metabolic imprinting that lead to chronic disease.Am J Clin Nutr，1999，69（2）：179-197.

［3］Eriksson JG，F(xiàn)orsen T，Tuomilehto J，et al.Effects of size at birth and childhood growth on the insulin resistance syndrome in elderly individuals.Diabetologia，2002，45 （3）：342-348.

［4］Remmers F，Delemarre-van de Waal HA.Developmental programming of energy balance and its hypothalamic regulation.Endocr Rev，2011，32（2）：272-311.

［5］Ploug T，Stallknecht BM，Pedersen O，et al.Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle.Am J Physiol，1990，259（6 Pt 1）：E778-786.

［6］趙麗軍，孫長顥，張曉紅，等.膳食鐵對飲食誘導肥胖大鼠代謝影響.中國公共衛(wèi)生，2006，22（1）：74-76.

［7］Gorski JN，Dunn-Meynell AA，Hartman TG，et al.Postnatal environment overrides genetic and prenatal factors influencing offspring obesity and insulin resistance.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，291（3）：R768-778.

［8］Druet C，Ong KK.Early childhood predictors of adult body composition.BestPractResClin EndocrinolMetab，2008，22（3）：489-502.

［9］Bi S，Scott KA，Hyun J，et al.Running wheel activity prevents hyperphagia and obesity in Otsuka long-evans Tokushima Fatty rats：role of hypothalamic signaling.Endocrinology，2005，146（4）：1676-1685.

［10］汪軍，田吉明.8周跑臺運動對肥胖大鼠下丘腦ghrelin和 obestatin 的影響.北京體育大學學報，2009，32（4）：57-60.

［11］Ozanne SE，Hales CN.The long-term consequences of intra-uterine protein malnutrition for glucose metabolism.Proc Nutr Soc，1999，58（3）：615-619.

［12］張曉宏，王舒然，趙麗軍.斷乳后不同飼料構(gòu)成對高脂膳食大鼠肥胖發(fā)生的影響.衛(wèi)生研究，2005，34 （4）：439-441.

［13］Racette SB，Coppack SW，Landt M，et al.Leptin production during moderate-intensity aerobic exercise.J Clin Endocrinol Metab，1997，82（7）：2275-2277.

［14］Kohrt WM，Landt M，Birge SJ Jr.Serum leptin levels are reduced in response to exercise training，but not hormone replacement therapy，in older women.J Clin Endocrinol Metab，1996，81（11）：3980-3985.

［15］李宏睿，孫文夏，潘杰.瘦素功能研究進展.中國動脈硬化雜志，2004，12（1）：108-112.

［16］胡建忠，王子樸.瘦素（Leptin）的生理作用機制及長期運動對其水平的影響.上海體育學院學報，2008，32（5）：41-43，94.

［17］Yamauchi T，Waki H，Kamon J，et al.Inhibition of RXR and PPARgamma ameliorates diet-induced obesity and type 2 diabetes.J Clin Invest，2001，108（7）：1001-1013.

［18］Prins JB，Niesler CU，Winterford CM，et al.Tumor necrosis factor-alpha induces apoptosis of human adipose cells.Diabetes，1997，46（12）：1939-1944.

［19］焦廣發(fā)，張海峰，高峰，等.12周游泳運動對高脂飲食大鼠脂肪組織UCP2mRNA和TNF-α的影響.中國運動醫(yī)學雜志，2009，28（3）：281-285.